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加味玉屏風(fēng)散及單味中藥對(duì)假絲酵母菌的體外抑菌作用

吳亞1，范世英2，魏宏蓮2，曹爽1

(1.河北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊050011)

摘要:目的觀察加味玉屏風(fēng)散及單味中藥對(duì)假絲酵母菌的體外抑菌效果，旨在尋求中藥在抗真菌方面的優(yōu)勢(shì)作用。方法用瓊脂稀釋法觀察加味玉屏風(fēng)散各組和單味中藥黃連、茵陳、炙黃芪對(duì)104株假絲酵母菌的體外抑菌作用。結(jié)果玉屏風(fēng)散+黃連、玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳、黃連的抑菌效果較好，50%最低抑菌濃度(MIC50)分別為6.25、25.00、1.56 g·L-1，且對(duì)熱帶假絲酵母菌的抑菌效果最好，其次為光滑假絲酵母菌、白假絲酵母菌和葡萄牙假絲酵母菌，對(duì)近平滑假絲酵母菌抑菌效果較差。玉屏風(fēng)散和炙黃芪僅對(duì)熱帶假絲酵母菌有一定抑菌效果，未發(fā)現(xiàn)茵陳對(duì)假絲酵母菌有抑菌作用。結(jié)論黃連及含黃連的加味玉屏風(fēng)散對(duì)各種假絲酵母菌均有抑制作用，尤其是對(duì)耐藥率較高的非白假絲酵母菌有較強(qiáng)的抑菌功效。這點(diǎn)對(duì)臨床研究更有價(jià)值。

關(guān)鍵詞:加味玉屏風(fēng)散；黃連；茵陳；炙黃芪；假絲酵母菌；瓊脂稀釋法

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑以及侵入性診斷治療的應(yīng)用，真菌感染的發(fā)病率日益增加。但目前臨床上應(yīng)用的西藥抗真菌藥物，存在毒性大、耐藥性增加、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。為了尋找中藥在抗真菌方面的優(yōu)勢(shì)作用，筆者對(duì)加味玉屏風(fēng)散及幾種單味中藥用瓊脂稀釋法進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，尋求中藥對(duì)真菌的抑菌功效。

1材料

1.1菌株2013年3月至2014年3月河北省中醫(yī)院微生物室分離的假絲酵母菌104株，其中白假絲酵母菌48株，熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌各20株，近平滑假絲酵母菌12株，葡萄牙假絲酵母菌4株，菌株分別來(lái)自患者的血液、中段尿和痰液標(biāo)本。質(zhì)控菌株為白假絲酵母菌90028。

1.2培養(yǎng)基(1)RoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)液體培養(yǎng)基：將RPMI1640粉末20.8g，葡萄糖40g，用0.33mol·L-1三嗎琳基丙磺酸(MOPS)緩沖液溶解，同時(shí)用1mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整pH值至6.9~7.1，最后定容至1L，過(guò)濾除菌備用。(2)4%瓊脂:將40g瓊脂溶于1 000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。

1.3藥液儲(chǔ)存液制備 (1)中藥制劑分組：A組：玉屏風(fēng)散(防風(fēng) ∶炙黃芪∶炒白術(shù)=1∶2 ∶2)；B組：玉屏風(fēng)散+黃連；C組：玉屏風(fēng)散+茵陳；D組：玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳；E組：炙黃芪；F組：黃連；G組：茵陳。(2)將中藥按常法做成煎液，即每組取中藥總量100g，加適量蒸餾水浸泡30min,強(qiáng)火加熱煮沸，再以文火煎煮30min，紗布過(guò)濾，濾渣再加適量蒸餾水煎煮30min，過(guò)濾棄渣，合并濾液，加熱濃縮到0.1L，即相當(dāng)于原生藥1 000g·L-1。121℃高壓滅菌20min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4主要儀器和試劑(1)高壓蒸汽消毒鍋：日本三洋株式會(huì)社產(chǎn)品；(2)電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京智拓儀器儀表有限公司產(chǎn)品；(3)比濁儀：法國(guó)梅里埃生物制品公司產(chǎn)品；(4)MIT-P多點(diǎn)接種儀：日本佐久間制作所產(chǎn)品；(5)沙保羅平板、瓊脂粉、葡萄糖均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；(6)RPMI1640粉：美國(guó)LifeTechnologiesInc產(chǎn)品；(7)MOPS粉：Fluka公司產(chǎn)品；(8)黃連、茵陳、黃芪(蜜炙)、防風(fēng)、白術(shù)(炒)：均購(gòu)于河北省藥材公司。

2方法

采用瓊脂稀釋法，對(duì)A~G組進(jìn)行定量抑菌試驗(yàn)。

2.1藥物平板制備將RPMI1640液體培養(yǎng)基與4%瓊脂于60℃ 1 ∶1混勻，分裝入試管中，每管分裝18mL,仍置60℃保溫。將倍比稀釋后的不同濃度的中藥液2mL加于試管中，輕輕振搖混勻，倒入直徑90mm平皿，置水平桌面使之凝固，最終配制成含中藥濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39g·L-1的藥物平板，并設(shè)不含中藥的瓊脂平板為生長(zhǎng)對(duì)照，不接種菌液且不含中藥的瓊脂平板做空白對(duì)照。

2.2菌懸液制備將104株受試菌和質(zhì)控菌株(白假絲酵母菌90028)在沙保羅平板連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，以確保菌落的純化和活力，第2次35℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)48h后取培養(yǎng)菌落用無(wú)菌生理鹽水分別配制成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木鷳乙骸?/p>

2.3培養(yǎng)與觀察用MIT-P多點(diǎn)接種儀將配制好的0.5麥?zhǔn)媳葷峋鷳乙?0μL接種于含不同中藥濃度的藥物平板和生長(zhǎng)對(duì)照平板上，于35℃培養(yǎng)48h，如果生長(zhǎng)對(duì)照平板假絲酵母菌全部生長(zhǎng)且空白對(duì)照平板無(wú)假絲酵母菌和雜菌生長(zhǎng)，則觀察含中藥各藥物平板的最低抑菌濃度(MIC)，并統(tǒng)計(jì)出50%最低抑菌濃度(MIC50) 和90%最低抑菌濃度(MIC90)的藥物濃度和累積抑菌百分率；同時(shí)觀察對(duì)各中藥制劑組對(duì)各種假絲酵母菌的最低抑菌濃度范圍(MIC范圍)。

3結(jié)果

3.1各中藥制劑組對(duì)假絲酵母菌的抑菌作用通過(guò)對(duì)104株假絲酵母菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明黃連(F組)的抑菌效果最好，MIC50和MIC90分別為1.56g·L-1和6.25g·L-1，其次是玉屏風(fēng)散+黃連(B組)和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳(D組)，其MIC50分別為6.25g·L-1和25.00g·L-1，茵陳(G組)的抑菌效果最差。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各中藥制劑組對(duì)104株假絲酵母菌

3.2各中藥制劑組對(duì)104株假絲酵母菌的累積抑菌百分率見(jiàn)表2。

表2　各中藥制劑組對(duì)104株假絲酵母菌的累積抑菌率比較/%

3.3各中藥制劑組對(duì)各種假絲酵母菌的抑菌作用玉屏風(fēng)散+黃連(B組)和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳(D組)和黃連(F組)對(duì)熱帶假絲酵母菌的抑菌效果最好，其次為光滑假絲酵母菌和白假絲酵母菌，對(duì)近平滑假絲酵母菌抑菌效果最差；玉屏風(fēng)散(A組)和炙黃芪(E組)僅對(duì)熱帶假絲酵母菌有一定抑菌作用。茵陳(G組)未檢出抑菌作用結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　各中藥制劑組對(duì)各種假絲酵母菌的MIC范圍/g·L-1

4討論

近年來(lái)隨著抗生素、激素、免疫抑制劑等藥物以及介入治療的廣泛應(yīng)用，臨床上真菌感染的比例大大增加，對(duì)抗真菌藥物的耐藥問(wèn)題也越來(lái)越突出，因此，開(kāi)發(fā)研究既可有效對(duì)抗真菌感染，毒副作用又較小，適合免疫力低下人群使用的抗真菌藥物顯得越來(lái)越重要。本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，進(jìn)行了復(fù)方中藥和單味中藥對(duì)104株假絲酵母菌的體外抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散+黃連、玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳、黃連對(duì)假絲酵母菌具有較強(qiáng)的體外抑菌作用，其 MIC50分別為6.25、25.00和1.56 g·L-1，且對(duì)熱帶假絲酵母菌抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)白假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌次之，對(duì)葡萄牙假絲酵母菌也有一定的抑制作用，對(duì)近平滑假絲酵母菌較差。與胡吉生等[1]報(bào)導(dǎo)黃連對(duì)念珠菌體外試驗(yàn)具有較強(qiáng)的抑菌作用,且黃連的抑菌效果最好相符。近年來(lái)非白假絲酵母菌(包括熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌等)引起的感染越來(lái)越受重視，這些非白假絲酵母菌對(duì)常用抗真菌藥物氟康唑都表現(xiàn)出較高的耐藥性[2]，本試驗(yàn)中無(wú)論是單味中藥黃連還是含黃連的復(fù)方中藥組都觀察到了對(duì)非白假絲酵母菌有較強(qiáng)的抑菌作用。黃連的臨床功效很強(qiáng)大，除了對(duì)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和不產(chǎn)酶的大腸埃希菌有抑菌作用[3]外，黃連的主要成分小檗堿對(duì)白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌的生長(zhǎng)均具抑制作用[4]。和劉濤峰等[5]報(bào)道黃連對(duì)白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌等的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有較強(qiáng)的抑菌作用一致。這一抑菌作用為臨床上對(duì)抗非白假絲酵母菌感染指出了一條可行之路。

假絲酵母菌屬引起的感染屬于機(jī)會(huì)性感染，常見(jiàn)于免疫力低下人群[2]。玉屏風(fēng)散，被稱(chēng)為中藥免疫調(diào)節(jié)劑，主治表虛自汗，易感風(fēng)邪。玉屏風(fēng)散能夠使單純腎病綜合征患兒免疫功能增強(qiáng),繼發(fā)性復(fù)發(fā)與感染的概率得到明顯降低[6-7]。玉屏風(fēng)散中的黃芪的重要化學(xué)成分黃芪多糖具有多種功效,包括增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等廣泛功效[8]。白術(shù)能夠提高細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。防風(fēng)有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、解熱、抗菌之作用。在假絲酵母菌感染治療時(shí)，玉屏風(fēng)散+黃連和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳不僅能提高機(jī)體免疫力，也能發(fā)揮抑制真菌作用。試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)茵陳的抗真菌作用，這與章林平等[9]報(bào)道茵陳揮發(fā)油中的茵陳炔酮有抑制真菌作用結(jié)果不一致，這可能與中藥的提取方式有關(guān)。有些具有抑制真菌作用的成分可能不溶于水，或者煎煮時(shí)不耐受高溫而被破壞或揮發(fā)，影響了抑菌效果，這些有待于進(jìn)一步研究和改進(jìn)工藝。

總之，無(wú)論是黃連還是含黃連的加味玉屏風(fēng)散制劑對(duì)假絲酵母菌都有較強(qiáng)的抑制作用，有研究表明[10]氟康唑與鹽酸小檗堿對(duì)耐藥真菌的協(xié)同作用,是通過(guò)增加真菌胞內(nèi)的鹽酸小檗堿含量?？梢?jiàn)，中西醫(yī)結(jié)合治療真菌感染也是一條可行之路。

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常用醫(yī)學(xué)名詞術(shù)語(yǔ)的規(guī)范表達(dá)

Inhibition test of the flavored yupingfeng powder and single traditional

Chinese medicine against candida in vitro

WU Ya1,FAN Shi-ying2, WEI Hong-lian2, et al

(1.HebeiTraditionalChineseMedicalHospital;2.TheSecondHospitalAffiliated

toHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveThroughobservingthein vitroinhibitioneffectsofflavoredyupinfengpowderandsingletraditionalChinesemedicineagainstcandida,toseektheantifungaleffectsoftraditionalChinesemedicine(TCM) .MethodsUsingAGARdilutionmethodtoobservein vitroinhibitioneffectoftheflavoredyupingfengpowderandsingletraditionalChinesemedicine(e.g.,rhizomacoptidis,herbaartemisiae,RadixAstragalipreparata)to104strainsofcandida.ResultsFungiinhibitioneffectsofYupingfengpowder+rhizomacoptidis,yupingfengpowder+rhizomacoptidis+herbaartemisiae,andrhizomacoptidisaregood.Theminimalinhibitoryconcentrationsof50% (MIC50)were6.25, 25.00and1.56g·L-1,respectively.Tropicalcandidashowedbestinhibitoryresponse,followedbysmooth-candida,whitecandidaandportugalcandida,whilenearlysmoothcandidatheworst.YupingfengpowderandRadixAstragalipreparatahascertainantifungaleffectsonlyfortropicalcandida.Herbaartemisiaedidn’tshowanyantifungaleffects.ConclusionsRhizomacoptidisandtheflavoredyupingfengpowderwithcoptishasstronginhibitionefficacyforavarietyofcandida,especiallyforthenon-Candidaalbicanswithhigherpercentages.Itismorevaluableforclinicalresearch.

Keywords:theflavoredyupinfengpowder;rhizomacoptidis;herbaartemisiae;radixastragalipreparata;candida;AGARdilutionmethod

(收稿日期：2014-06-26，修回日期：2014-07-28)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.055

基金項(xiàng)目：河北省中醫(yī)藥管理局2013年科研計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013048)