武犁 周蕓蕓 陳櫻

·臨床研究·

程序性細胞死亡因子4在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中的表達及與臨床病理的關(guān)系研究

武犁 周蕓蕓 陳櫻

目的探討視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)組織中程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的表達及其與臨床分期和組織分化的關(guān)系。方法應用免疫組織化學S-P法檢測PDCD4在35例RB組織中的表達；用MPIAS-500彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量其平均積分光密度值。結(jié)果在35例RB組織切片中，均可見PDCD4的陽性表達，其表達水平明顯低于正常視網(wǎng)膜組織(P<0.05)；眼外擴展期組PDCD4的表達水平明顯低于眼內(nèi)生長期組和眼壓增高期組(P<0.05)；PDCD4 在RB的陽性表達水平與腫瘤組織的分化程度及視神經(jīng)浸潤顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論PDCD4蛋白表達水平與RB的臨床分期、視神經(jīng)浸潤以及組織分化有關(guān)，PDCD4可作為判斷RB浸潤及預后的指標。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：403-405)

視網(wǎng)膜母細胞瘤；程序性細胞死亡因子4；免疫組織化學；組織分化

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于胚胎型視網(wǎng)膜細胞的惡性腫瘤，是嬰幼兒最常見、最嚴重的眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴重危害患兒視力甚至生命[1]。作為第1個分離出的人類抑癌基因，RB基因突變而導致的失活是RB發(fā)生的重要機制。程序性細胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4) 作為近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能夠通過抑制蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯過程抑制腫瘤細胞的生長。有研究[2-5]提示：PDCD4 的表達水平可能與包括RB在內(nèi)的某些腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)。我們采用免疫組織化學方法探討新抑癌基因PDCD4蛋白的表達與RB的臨床分期及組織分化的相關(guān)性，為RB的病情進展及預后判斷提供理論依據(jù)，報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 經(jīng)臨床病理證實為RB且資料完整的RB患者35例，其中男性22例、女性13例；年齡9個月～12歲，平均 (3.8±1.6)歲。均為單眼發(fā)病，右眼15例、左眼20例。按照傳統(tǒng)臨床分期[6]，本組病例中，眼內(nèi)生長期11例，眼壓增高期14例，眼外擴展期10例。眼壓增高是通過非接觸式眼壓計或修氏眼壓計進行測量。依據(jù)Stannard等[7]的分類方法，根據(jù)視神經(jīng)受侵犯程度來分，N0：視神經(jīng)未受侵襲；N1：腫瘤侵犯視乳頭，但局限于篩板內(nèi)；N2：腫瘤侵犯篩板后視神經(jīng)，但視神經(jīng)切除斷端未見腫瘤；N3：視神經(jīng)斷端可見腫瘤。本組病例中，N0期14例、N1期8例、N2期9例、N3期4例。按照蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色病理切片的表現(xiàn)來分，R0：腫瘤細胞不呈菊花團排列(每高倍鏡視野內(nèi)菊花團排列數(shù)<3個)；R1：僅有少數(shù)腫瘤細胞呈菊花團排列(每高倍鏡視野內(nèi)菊花團排列數(shù)3～5個)；R2：多數(shù)腫瘤細胞呈菊花團排列(每高倍鏡視野菊花團排列數(shù)>5個)。本組病例中，R0 15例、R1 6例、R2 14例。所有RB患者的腫瘤組織均取自球內(nèi)。另取6例角膜移植供體眼視網(wǎng)膜組織作為對照，供體眼均為自愿捐獻者，無視網(wǎng)膜疾病史。

1.2 主要試劑 鼠抗人PDCD4多克隆抗體；免疫組織化學S-P試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine, DAB)顯色劑及中性樹膠等均采購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學染色 采用S-P法進行染色，主要步驟如下：石蠟標本行4.0 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，梯度乙醇水化，30 g/L過氧化氫溶液室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；微波修復抗原，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗；滴加一抗，4 ℃濕盒過夜；漂洗后，滴加二抗工作液，37 ℃濕盒內(nèi)孵育30 min；洗滌后，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，置濕盒內(nèi)，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果；滿意后水洗終止，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。PBS代替一抗做陰性對照。每個病例做5張切片，重復3次。利用MPIAS-500彩色病理圖像分析系統(tǒng)光學顯微鏡下觀察并測量PDCD4蛋白在正常視網(wǎng)膜和RB組織中的積分光密度，每張切片選取10 個視野。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4蛋白表達 在35例RB組織切片中均可見PDCD4蛋白陽性表達 (圖1)，平均積分光密度值為0.197±0.014；6例正常視網(wǎng)膜組織中，PDCD4蛋白亦呈陽性表達，平均積分光密度值為0.225±0.013，明顯高于RB組織，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.2 PDCD4蛋白表達水平與臨床分期及視神經(jīng)浸潤的關(guān)系 PDCD4蛋白表達在眼內(nèi)生長期組、眼壓增高期組和眼外擴展期組的積分光密度值分別為0.210±0.012、0.207±0.010和0.169±0.014。眼外擴展期組明顯低于眼內(nèi)生長期組和眼壓增高期組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而眼內(nèi)生長期和眼壓增高期組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1. PDCD4在RB組織中的陽性表達 SP×400

PDCD4 蛋白在N0期、N1期、N2期和N3期各組的積分光密度值分別為：0.214±0.012、0.207±0.013、0.187±0.011和0.178±0.009，PDCD4蛋白積分光密度值與腫瘤組織視神經(jīng)浸潤相關(guān)(P<0.05)，視神經(jīng)浸潤組PDCD4蛋白積分光密度值明顯低于視神經(jīng)無浸潤組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

2.3 PDCD4蛋白表達水平與病理組織分化的關(guān)系 35例RB中，不同分化型組織中PDCD4蛋白積分光密度值分別如下，R0： 0.182±0.011，R1:0.198±0.012，R2：0.224±0.011，PDCD4蛋白積分光密度值與腫瘤組織分化程度相關(guān)(P<0.05)，未分化組PDCD4蛋白積分光密度值明顯低于分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

PDCD4是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，它定位于染色體10q24。PDCD4蛋白由 469個氨基酸組成，包含N末端結(jié)構(gòu)域、 C末端結(jié)構(gòu)域和2個保守的α螺旋MA-3結(jié)構(gòu)域[2]。雖然PDCD4基因在腫瘤發(fā)生中的詳細作用機制尚不清楚[2-3]，但是已有的研究顯示：PDCD4基因可能通過多種途徑參與細胞凋亡調(diào)控，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用。有研究[8-9]表明：PDCD4可能在轉(zhuǎn)錄、翻譯和信號轉(zhuǎn)導途徑中通過抑制轉(zhuǎn)錄阻遏基因EIF4A，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，最終抑制了細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。另有研究[10-11]證明，PDCD4 mRNA水平在膠質(zhì)瘤中表達缺失率為47%，而蛋白表達的缺失率達到了77%，從而推測PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達缺失應該比較常見。還有研究[12]發(fā)現(xiàn)，PDCD4轉(zhuǎn)染可以抑制U251細胞的細胞增殖和克隆，并且影響了U251細胞系的細胞周期，使細胞周期停留在S期，從而抑制腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。Shen等[5]的研究顯示：miR-21下調(diào)引起突變RB基因的表達，而PDCD4可能在這一過程中發(fā)揮著重要的作用，提示PDCD4可能與RB的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

有報道[13]稱,低表達的PDCD4 與胃癌的臨床分期進展、組織浸潤深度及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ren 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183的過表達可抑制PDCD4 的功能，從而導致食管鱗狀細胞癌的增殖和侵襲。我們的研究結(jié)果與此類似，發(fā)現(xiàn)：PDCD4蛋白在RB患者眼外擴展期組表達明顯低于眼內(nèi)生長期組和眼壓增高期組，差異有統(tǒng)計學意義；而眼內(nèi)生長期和眼壓增高期組間差異無統(tǒng)計學意義。同時，RB腫瘤細胞浸潤視神經(jīng)組PDCD4蛋白表達量明顯低于未浸潤組，表明PDCD4蛋白表達不僅與RB的臨床分期有關(guān)，而且與RB的視神經(jīng)浸潤能力有關(guān)，即RB組織中PDCD4蛋白表達量越低，其浸潤潛能越強，也就越易發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移。

我們的觀察結(jié)果還顯示：RB組織中，PDCD4蛋白表達與組織分化程度有關(guān)，未分化型PDCD4蛋白的表達量明顯低于分化型。Tu等[15]也發(fā)現(xiàn)胃癌組織的PDCD4 蛋白表達與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)，即高分化的胃癌表現(xiàn)為高表達PDCD4 蛋白，低分化的胃癌表現(xiàn)為低表達PDCD4 蛋白。以上結(jié)果說明，細胞分化差和增殖能力強的腫瘤轉(zhuǎn)移潛能大，其預后會更差。因此，觀察RB組織中PDCD4蛋白的表達對了解RB的組織學特性也有重要的意義。

綜上所述，PDCD4蛋白表達與RB的臨床分期及組織分化具有重要的相關(guān)性，PDCD4可作為判斷RB的惡性程度、視神經(jīng)浸潤以及轉(zhuǎn)移的重要指標，深入探討 PDCD4蛋白與RB的相關(guān)性對RB的治療與預后判斷具有重要的指導意義。

[1] Melamud A, Palekar R, Singh A. Retinoblastoma [J]. Am Fam Physician, 2006, 73(6): 1039-1044.

[2] Lankat-Buttgereit B, G?ke R. The tumour suppressor Pdcd4: recent advances in the elucidation of function and regulation [J]. Biol Cell, 2009, 101(6): 309-317.

[3] Vikhreva PN, Shepelev MV, Korobko EV, et al. Pdcd4 tumor suppressor: properties, functions, and their application to oncology [J]. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 2010, (2): 3-11.

[4] Li X, Xin S, He Z, et al. MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumor suppressor PDCD4 and promotes cell transformation, proliferation, and metastasis in renal cell carcinoma [J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 33(6): 1631-1642.

[5] Shen FM, Mo MH, Chen L, et al. MicroRNA-21 down-regulates Rb1 expression by targeting PDCD4 in retinoblastoma [J]. J Cancer, 2014, 5(9)：804-812.

[6] 曾一平，張曉農(nóng)．視網(wǎng)膜母細胞瘤的臨床病理及預后[J]．中國實用眼科雜志, 1997, 15(2)：99-101．

[7] Stannard C，Lipner S，Scaly R，et al. Retinoblastoma: correlation of invasion of the optic nerve and choroids with prognosis and metastasis [J]．Br J Ophthalmol，1979，63(8)：560-570.

[8] Suzuki C, Garces RG, Edmonds KA, et al. PDCD4 inhibits translation initiation by binding to eIF4A using both its Ma3 domains [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(9): 3274-3279.

[9] Chang JH, Cho YH, Sohn SY, et al. Crystal structure of the eIF4A-PDCD4 complex [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(9): 3148-3153.

[10] Gao F, Zhang P, Zhou C, et al. Frequent loss of PDCD4 expression in huma nglioma:possible role in the tumorigenesis of glioma[J]. Oncol Rep, 2007, 17(1): 123-128.

[11] Hwang SK, Baker AR, Young MR, et al. Tumor suppressor PDCD4 inhibits NF-κB-dependent transcription in human glioblastoma cells by direct interaction with p65 [J]. Carcinogenesis, 2014, 35(7): 1469-1480.

[12] 張霞,王曉燕,高琪,等. PDCD4在膠質(zhì)瘤細胞系的穩(wěn)定表達及其對腫瘤細胞生長的影響 [J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2008, 15(4): 347-350.

[13] Gu W, Gao T, Shen J, et al. MicroRNA-183 inhibits apoptosis and promotes proliferation and invasion of gastric cancer cells by targeting PDCD4 [J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(9): 2519-2529.

[14] Ren LH, Chen WX, Li S, et al. MicroRNA-183 promotes proliferation and invasion in oesophageal squamous cell carcinoma by targeting programmed cell death 4 [J]. Br J Cancer，2014，111(10): 2003-2013.

[15] Tu H, Sun H, Lin Y, et al. Oxidative stress upregulates PDCD4 expression in patients with gastric cancer via miR-21 [J]. Curr Pharm Des，2014，20(11): 1917-1923.

(本文編輯 諸靜英)

Expression of programmed cell death 4 and its relationship with clinical stage and histodifferentiation in retinoblastoma

WULi,ZHOUYun-yun,CHENYing.

DepartmentofOphthalmology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

WU Li, Email: wlpzy2007@163.com

Objective To investigate the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in retinoblastoma (RB) and its relationship with clinical stage and histodifferentiation. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of PDCD4 in RB samples of 35 cases. The quantitative analysis of the PDCD4 expression was assessed by using MPIAS-500 color pathologic analysis system. Results PDCD4 was expressed positively in the all 35 Rb specimens. The level of PDCD4 expression was significantly lower in RB than that in normal retina tissues (P<0.05). The expression of PDCD4 was related to the histodifferentiation and optic nerve infiltration (P<0.05). Conclusions The expressions of PDCD4 was associated with clinical stage and histodifferentiation in RB. PDCD4 may become a new marker for the invasion and prognosis of RB. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:403-405)

Retinoblastoma；Programed cell death 4；Immunohistochemistry；Histodifferentiation

武漢大學人民醫(yī)院眼科 武漢 430060

武犁 (Email: wlpzy2007@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.008

2015-06-05)