劉瑩瑩 蘇碧麗 龐文生 胡娟

實(shí)驗(yàn)研究

野葛、粉葛水煎液和醇提液中3種異黃酮成分含量的比較研究

劉瑩瑩 蘇碧麗 龐文生 胡娟

目的對(duì)野葛、粉葛飲片水煎液和醇提液中3種主要成分含量進(jìn)行比較研究, 探討兩種葛根主要成分的差異。方法采用高效液相色譜法測(cè)定野葛和粉葛水煎液、乙醇提取液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量。結(jié)果野葛與粉葛相比, 無(wú)論在醇提液還是水煎液中, 野葛中的3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元這三個(gè)成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羥基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量與野葛醇提液基本相同；但是在粉葛醇提液中這三個(gè)成分含量略高于水煎液。結(jié)論在醇提液和水煎液中,野葛的3種異黃酮成分含量均高于粉葛。

葛根為豆科葛屬野葛 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根, 習(xí)稱野葛。而葛根的另一來(lái)源豆科葛屬甘葛藤P. thomsonii Behth. 的干燥根, 稱為粉葛。兩者均載于《中國(guó)藥典》, 并廣泛應(yīng)用于臨床。葛根味甘、辛、涼, 具有解肌退熱、生津、透疹、升陽(yáng)止瀉之功效［1］。有文獻(xiàn)報(bào)道葛根的主要活性成分是3’-羥基葛根素、葛根素及大豆苷元等異黃酮類化合物［2-4］, 其具有降血壓、保肝、降血糖、降血脂、治療頸椎病等療效［5-7］。2010版藥典中葛根與粉葛的質(zhì)量控制指標(biāo)是測(cè)定葛根素含量［8］。多指標(biāo)成分含量的同時(shí)測(cè)定是當(dāng)今中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)［9-11］。葛根乙醇提取液中多種成分的同時(shí)測(cè)定已有報(bào)道［12,13］, 但野葛、粉葛水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素及大豆苷元3種異黃酮成分的含量測(cè)定未見報(bào)道。中藥煎煮是中藥飲片臨床用藥的主要方式, 水煎液中有效成分的含量對(duì)中藥飲片發(fā)揮藥效起著至關(guān)重要的作用。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葛根醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素、大豆苷元的含量, 對(duì)比野葛、粉葛三種異黃酮成分的差異, 評(píng)價(jià)其質(zhì)量, 為葛根的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng),2998型二極管陣列檢測(cè)器, Empower3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó) Waters 公司), KQ250E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), Milli-Q 超純水設(shè)備(美國(guó) Millipore 公司), 濾膜(美國(guó)Millipore 公司, 孔徑0.45 μm)。

1.2 試劑與藥材 葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào)：110752-201313)；3’-羥基葛根素對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司, 批號(hào)：130416)；大豆苷元對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào)：111502-200402)；野葛購(gòu)自福建祥安藥業(yè)有限公司(上?？禈蛑兴庯嬈酚邢薰? 產(chǎn)地：四川, 批號(hào)：120509、120513、120520)；粉葛購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂(安徽源和堂藥業(yè)股份有限公司, 產(chǎn)地：廣西,批號(hào)：1202201、1202205、1202209)；乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 分析純), 甲醇、乙腈(德國(guó) Merck 公司, 色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30℃；對(duì)照品、醇提液、水煎液進(jìn)樣體積分別為：10、20、6 μl；流速：1.0 ml/min；梯度洗脫程序見表1。在此色譜條件下各對(duì)照品和供試品色譜圖見圖1, 色譜圖中3個(gè)成分分離良好。

表1 梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備 樣品的測(cè)定方法參照《中國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄Ⅵ D 高效液相色譜法外標(biāo)法測(cè)定, 具體操作方法如下。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對(duì)照品1.66、1.65、2.06 mg, 分別用甲醇溶解,定容至5 ml, 得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對(duì)照品儲(chǔ)備液, 精密量取上述各溶液3 ml 置于容量瓶中, 搖勻, 作為3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對(duì)照品溶液, 對(duì)照品濃度分別為0.11、0.11、0.14 mg/ml。

2.2.2 野葛和粉葛醇提液供試液的制備 取葛根(0.5 g)、粉葛(0.5 g)飲片粉末, 精密稱定, 分別置于具塞錐形瓶中, 精密加入30％乙醇50 ml, 超聲30 min, 放冷, 定容至50 ml, 然后搖勻, 濾過。取續(xù)濾液, 即得野葛和粉葛醇提液供試液,其生藥量分別為10.00、10.00 mg/ml。

2.2.3 野葛和粉葛水煎液供試液的制備 分別精密稱取野葛飲片和粉葛飲片50 g, 浸泡15 min, 分別加水煎煮2次(每次加水量為500 ml；每次煎煮時(shí)間為30 min), 趁熱用四層紗布濾過。合并濾液, 分別得到860、870 ml濾液, 即得野葛和粉葛水煎液供試品溶液, 其生藥量分別為58.14、57.47 mg/ml。

2.3 線性范圍考察 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.01、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml, 置于10 ml容量瓶?jī)?nèi),以甲醇定容至刻度, 經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾, 得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果表明：3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的濃度在 0.11～27.50、0.11～27.50、0.14～0.35 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品混合溶液(3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的濃度分別為0.11、0.11、0.14 mg/ml),于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次, 測(cè)得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.67％、0.56％、0.83％, 日內(nèi)精密度良好, 表明儀器較為穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批葛根飲片, 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試液溶液, 各平行6份。

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 分別記錄各色譜峰面積。計(jì)算得野葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分別為0.77％、2.87％、0.10％和0.23％、0.86％、0.86％, RSD依次為1.02％、1.32％、1.28％和1.09％、1.22％、1.27％；粉葛飲片和水煎液中葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分別為0.653％、0.098％和0.077％、0.008％, RSD分別為1.34％、1.01％和0.64％、1.08％。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取野葛、粉葛醇提液供試品溶液和野葛、粉葛水煎液供試品溶液, 分別于1、2、3、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定, 記錄峰面積。結(jié)果顯示, 野葛醇提液供試液日內(nèi)穩(wěn)定性的RSD=0.48％ (n=6), 粉葛醇提液供試液日內(nèi)穩(wěn)定性的RSD=0.29％ (n=6), 野葛水煎液供試液日內(nèi)穩(wěn)定性的RSD=0.67％ (n=6), 粉葛水煎液供試液日內(nèi)穩(wěn)定性的RSD=0.69％ (n=6), 表明表明野葛、粉葛醇提液供試液和野葛、粉葛水煎液供試液的穩(wěn)定性良好。

2.7 定量限和檢測(cè)限 將各對(duì)照品溶液梯度稀釋至一定濃度, 以信噪比3：1為檢測(cè)限(LOQ), 以信噪比10：1為定量限進(jìn)行測(cè)定(LOD), 測(cè)得3’-羥基葛根素的定量限為45.3 ng/ml,檢測(cè)限為15.4 ng/ml；葛根素的定量限為73.5 ng/ml, 檢測(cè)限為21.4 ng/ml；大豆苷元的定量限為55.1 ng/ml, 檢測(cè)限為18.2 ng/ml。

2.8 計(jì)算方法 供試品的百分含量計(jì)算公式為：

公式中, AX為供試品的峰面積；AR為對(duì)照品的峰面積；mR為對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量；MX為供試品的進(jìn)樣生藥量。

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取3個(gè)批次的樣品, 分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備野葛和粉葛醇提液供試液及水煎液供試品溶液, 各平行3次。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元含量。測(cè)定結(jié)果見表2, 色譜圖見圖1。

表2 野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量(n=3, ％)

3 討論

野葛和粉葛中雖主要含有3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元等異黃酮成分, 但兩個(gè)品種中各種異黃酮的含量具有一定差別, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 無(wú)論在醇提液還是水煎液中,野葛中的3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元這三個(gè)成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羥基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量與野葛醇提液相同；但是在粉葛醇提液中這三個(gè)成分含量略高于水煎液。粉葛中化學(xué)成分不僅在種類和含量上不如野葛, 而且其化學(xué)成分還較難融入到湯劑中, 這可能與粉葛富含淀粉, 水煮時(shí), 淀粉粒易糊化, 在飲片表面形成保護(hù)膜, 有效成分不易煎出有關(guān),故臨床使用葛根優(yōu)先選用野葛；但因粉葛栽培產(chǎn)量高, 并且富含淀粉, 適用于養(yǎng)生保健原料。

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Comparative study of three kinds of isoflavonoid in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii

LIU Ying-ying, SU Bi-li, PANG Wen-sheng, et al. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou350122, China

ObjectiveTo compare contents of three kinds of main elements in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii, and to investigate the main difference between the two kinds of pueraria lobata.MethodsThe contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii were detected by high performance liquid chromatography.ResultsPueraria lobata had higher contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in both ethanol extracts and decoction than pueraria thomsonii. The content of3’-hydroxy puerarin in decoction of pueraria lobata was6.63 times of that in ethanol extracts, and the content of puerarin in decoction of pueraria lobata was3.49 times of that in ethanol extracts. The content of daidzein in decoction of pueraria lobata was basically the same as that in ethanol extracts. The ethanol extracts of pueraria thomsonii had larger contents of the three elements than the decoction.ConclusionThe contents of three kinds of isoflavonoid in the decoction and ethanol extracts of pueraria lobata are higher than those of pueraria thomsonii.

Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; Puerarin;3’-hydroxy puerarin; Daidzein

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.194

2014-11-26］

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：81274050)

350122 福建中醫(yī)藥大學(xué)

胡娟

【關(guān)鍵詞】野葛；粉葛；葛根素；3’-羥基葛根素；大豆苷元