AMPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞抗菌性自噬效應(yīng)中的作用

范仕郡，祝元鋒，楊永軍，劉　鑫　(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

·論著·

AMPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞抗菌性自噬效應(yīng)中的作用

范仕郡，祝元鋒，楊永軍，劉鑫(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

[摘要]目的觀察AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞自噬及殺菌活性的調(diào)節(jié)作用,并探討其可能機(jī)制。方法分離和體外培養(yǎng)小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞(BMDM)，觀察大腸埃希菌刺激后對(duì)BMDM細(xì)胞自噬水平及AMPK活化狀態(tài)的影響。使用AMPK激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)其活化，進(jìn)一步觀察大腸埃希菌感染的BMDM細(xì)胞中AMPK活化、自噬水平以及殺菌能力的變化。結(jié)果大腸埃希菌感染后的小鼠BMDM細(xì)胞自噬相關(guān)分子LC3B和Beclin1的表達(dá)顯著升高，同時(shí)LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明顯升高，且其AMPK的磷酸化水平也隨之顯著上調(diào)。AMPK活性增強(qiáng)后，能夠進(jìn)一步上調(diào)BMDM細(xì)胞的自噬水平以及對(duì)細(xì)菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后，細(xì)胞自噬水平和殺菌活性均顯著下降。結(jié)論AMPK分子及其相關(guān)信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬水平以及抗菌效應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]AMPK；小鼠骨髓巨噬細(xì)胞；抗菌性自噬

自噬(autophagy)是一種細(xì)胞內(nèi)的“自食(self eating)”現(xiàn)象[1-2]。細(xì)胞通過(guò)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，包裹胞質(zhì)和細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解清除，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[3]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在天然免疫細(xì)胞中，自噬體還可包裹和清除入侵細(xì)胞內(nèi)的病原體，這一作用也被稱為抗菌性自噬作用(antibacterial autophagy)[4-5]。目前有關(guān)抗菌性自噬的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。AMP依賴的蛋白激酶(5’ adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶分子，在機(jī)體生物能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[6-7]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK對(duì)于自噬和炎癥的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要[8-9]。然而該通路是否與免疫細(xì)胞中抗菌性自噬效應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，目前尚不清楚。本文以小鼠骨髓巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察AMPK通路對(duì)于細(xì)胞自噬功能及抗菌效應(yīng)的影響，以期闡明調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抗菌性自噬作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35218購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。胰蛋白胨、酵母提取物、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、saponin(細(xì)胞裂解液)、AICAR(AMPK激動(dòng)劑)和Compound C(AMPK抑制劑)等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。LC3B、AMPK、pAMPK、F4/80、tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、彩色預(yù)染蛋白marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、4%多聚甲醛溶液、DAPI(細(xì)胞核染液)及BSA等購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。Trizol 總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司，生理鹽水購(gòu)自西南藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備恒溫?fù)u床、電泳儀、定量PCR儀、核酸蛋白儀、高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、細(xì)菌計(jì)數(shù)系統(tǒng)、普通孵箱、CO2孵箱、倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)的分離及體外培養(yǎng)BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡1 min，取出瀝干酒精放置于方盤，將小鼠后肢的皮毛剝至足部，剪下后肢并放置在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，剔除肌肉，在關(guān)節(jié)處剪斷股骨和脛骨，用1 mL注射器吸取生理鹽水，注入骨髓腔并反復(fù)沖洗5次，將骨髓沖洗液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管。4 ℃條件下，1 000 rpm離心5 min，用10 mL含10%血清和50 ng/mL M-CSF的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，換5 mL含MCSF(50 ng/mL)和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后備用。

1.2.2大腸埃希菌的體外培養(yǎng)及BMDM細(xì)胞刺激處理挑取接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落，轉(zhuǎn)移至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，250轉(zhuǎn)增菌培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.8左右(換算所得菌液濃度為5×107/mL～8×107/mL)，離心棄上清，PBS洗滌2次并重懸菌液。將菌液按照與細(xì)胞比例為10∶1加入BMDM細(xì)胞中，孵育1 h后PBS洗滌細(xì)胞3次，加入AMPK或SIRT1的激動(dòng)劑或抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后洗滌細(xì)胞3次，加入0.3% saponin裂解細(xì)胞，稀釋后取100 μl涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.3免疫熒光染色將小鼠BMDM細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，1%BSA室溫封閉1 h，加入F4/80的一抗(1∶400稀釋)。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)將小鼠BMDM細(xì)胞加入1 mL Trizol裂解液，離心取上清按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。行反轉(zhuǎn)錄及realtime-PCR反應(yīng)，通過(guò)2-ΔΔCt的方法計(jì)算LC3B和Beclin1基因?qū)τ趦?nèi)參基因β-actin的相對(duì)定量比值[10]。

1.2.5western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)將小鼠BMDM細(xì)胞加入RIPA培養(yǎng)基，離心取上清胞漿蛋白，蛋白定量后經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(1∶1 000)過(guò)夜孵育，加入二抗(1∶2 000)并進(jìn)行化學(xué)發(fā)光曝光處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1小鼠BMDM細(xì)胞的形態(tài)及鑒定

小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)后，在M-CSF的刺激下逐步增殖分化為BMDM細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞呈橢圓形、多角形或不規(guī)則形，部分貼壁。培養(yǎng)48 h后可以觀察到細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶，大部分出現(xiàn)偽足。部分細(xì)胞伸展開并牢固黏附在培養(yǎng)瓶表面，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的梭形，貼壁良好。通過(guò)免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80(紅色)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎均為陽(yáng)性著色，提示分化細(xì)胞的純度較好(圖1～2)。

a:小鼠BMDM細(xì)胞24 h形態(tài);b:小鼠BMDM細(xì)胞48 h形態(tài)

a:F4/80(紅色);b:DAPI(藍(lán)色);c:合并

2.2大腸埃希菌對(duì)BMDM細(xì)胞胞內(nèi)自噬水平和AMPK的磷酸化水平的影響

大腸埃希菌作用于小鼠BMDM細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的mRNA表達(dá)較未處理組細(xì)胞顯著上調(diào)(P<0.01)。同時(shí)經(jīng)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌也可上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ比值，表明大腸埃希菌能夠上調(diào)BMDM細(xì)胞的自噬水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌還可促進(jìn)AMPK的磷酸化，提示其誘發(fā)的自噬可能與上調(diào)AMPK的活化水平有關(guān)(圖3)。

2.3AMPK對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的自噬水平和大腸埃希菌胞內(nèi)降解的影響

為明確AMPK通路是否對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的抗菌性自噬效應(yīng)具有調(diào)控作用，我們采用AMPK激動(dòng)劑AICAR(1 mM)和抑制劑Compound C(10 μM)處理大腸埃希菌感染的BMDM細(xì)胞，觀察到AICAR作用后可進(jìn)一步上調(diào)LC3B的表達(dá)以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，同時(shí)胞內(nèi)活菌數(shù)目較單獨(dú)大腸埃希菌感染組細(xì)胞顯著降低(P<0.01)，而Compound C則可下調(diào)LC3B的表達(dá)以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)，同時(shí)胞內(nèi)活菌數(shù)目較單獨(dú)大腸埃希菌感染組細(xì)胞顯著升高(P<0.01)，見圖4～5。

*:與medium組比較，P<0.01

圖3大腸埃希菌(EC)對(duì)BMDM細(xì)胞自噬水平以及AMPK活化的影響

*:與EC組比較，P<0.05;#:與EC組比較，P<0.01

圖4AMPK激動(dòng)劑(AICAR)和抑制劑(Compound C)對(duì)大腸埃希菌(EC)感染BMDM細(xì)胞自噬水平的影響

3討論

自噬的激活對(duì)于胞內(nèi)細(xì)菌的清除具有重要意義，然而引發(fā)細(xì)胞抗菌性自噬的調(diào)控機(jī)制尚未闡明[11-12]。

*:與EC組比較，P<0.01

圖5AMPK激動(dòng)劑(AICAR)和抑制劑(Compound C)對(duì)BMDM胞內(nèi)大腸埃希菌(EC)降解的影響

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌感染后的小鼠BMDM細(xì)胞，其自噬水平顯著升高，同時(shí)AMPK的磷酸化水平也顯著上調(diào)。而通過(guò)化學(xué)抑制劑的方法增加或抑制AMPK的活性，能夠影響B(tài)MDM細(xì)胞的自噬水平以及對(duì)細(xì)菌的降解清除，提示AMPK分子及其相關(guān)信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平以及抗菌免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

為對(duì)吞噬細(xì)胞中抗菌性自噬效應(yīng)進(jìn)行研究，我們參考文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(BMDM)的分離和分化方法進(jìn)行了摸索[13]，并通過(guò)活細(xì)胞染色和細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)的方法對(duì)獲得的BMDM細(xì)胞進(jìn)行了活力和純度分析，最終建立滿足后續(xù)研究需求的細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)方法。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)，天然免疫細(xì)胞的自噬水平與其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和殺菌活性密切相關(guān)[14]。吞噬細(xì)胞自噬水平的上調(diào)，可增強(qiáng)對(duì)結(jié)合分支桿菌和沙門氏菌等胞內(nèi)寄生菌的降解清除[15]。大腸埃希菌雖不是特有的胞內(nèi)寄生菌，但其也可侵入吞噬細(xì)胞中，引發(fā)細(xì)胞凋亡，影響對(duì)細(xì)菌的吞噬和殺傷。免疫功能低下的患者注射免疫球蛋白后，其外周血中心粒細(xì)胞的自噬水平顯著提高，進(jìn)而對(duì)多重耐藥的大腸埃希菌殺傷能力也明顯增強(qiáng)[16]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，使用熒光標(biāo)記的大腸埃希菌與小鼠骨髓巨噬細(xì)胞共孵育后，可在胞內(nèi)觀察到吞噬入胞的大腸埃希菌，且與自噬體發(fā)生了明確的共定位現(xiàn)象。在本研究中，我們進(jìn)一步證實(shí)，大腸埃希菌可上調(diào)自噬相關(guān)分子LC3B和Beclin1的表達(dá)，且能夠增加LC3Ⅱ/Ⅰ的比值。該結(jié)果提示，大腸埃希菌能夠直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生。

AMPK是細(xì)胞能量代謝的核心調(diào)控分子。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，AMPK分子也直接參與了對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控。AMPK可抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Targer of Rapamycin, mTOR)的活性，同時(shí)激活Beclin1/PI3KⅢ復(fù)合物，激活細(xì)胞自噬效應(yīng)[8]。大量研究顯示，AMPK分子在能量代謝和腫瘤相關(guān)的自噬調(diào)控中具有重要作用[17]。但其是否參與了對(duì)細(xì)菌介導(dǎo)的自噬效應(yīng)的調(diào)控，目前尚不明確。因此我們首先檢測(cè)了小鼠BMDM細(xì)胞中AMPK分子的活化水平。結(jié)果顯示，大腸埃希菌處理的小鼠BMDM細(xì)胞中，AMPK分子的磷酸化水平明顯增加。上述結(jié)果提示，AMPK分子可能對(duì)大腸埃希菌介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬反應(yīng)具有調(diào)控作用。為明確該設(shè)想，我們使用AMPK的激動(dòng)劑AICAR和抑制劑Compound C改變其活性，觀察對(duì)細(xì)胞自噬和細(xì)菌降解作用的影響[18-19]。結(jié)果顯示，AMPK激動(dòng)劑能夠增加其磷酸化水平，同時(shí)進(jìn)一步上調(diào)自噬分子LC3B的mRNA表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(相對(duì)于單獨(dú)的細(xì)菌處理組)。與此相反的是，AMPK的抑制劑Compound C可下調(diào)LC3B的表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值。在細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AMPK激活后，BMDM胞內(nèi)活菌數(shù)量顯著降低，而AMPK受抑制后，胞內(nèi)活菌數(shù)量顯著升高。該結(jié)果表明，AMPK對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的殺菌作用具有正調(diào)控效應(yīng)。該結(jié)果與AMPK對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用一致，提示AMPK可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而增強(qiáng)殺菌活性。

綜上，本研究對(duì)引發(fā)細(xì)胞抗菌性自噬的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞自噬水平的上調(diào)效應(yīng)，并證實(shí)該作用與其激活A(yù)MPK分子，進(jìn)而上調(diào)自噬相關(guān)分子的表達(dá)和活化有關(guān)。我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，AMPK分子的活化，還能夠直接影響巨噬細(xì)胞細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的降解清除，提示AMPK分子及其相關(guān)信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平以及抗菌免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，并有可能是機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答的重要信號(hào)機(jī)制之一。

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(編輯：楊穎)

Role of AMPK signaling pathway in regulating antibacterial autophagy in murine bone marrow derived macrophages

FAN Shi-jun，ZHU Yuan-feng，YANG Yong-jun，LIU Xin

(Medical Research Center, Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the regulatory effects and possible mechanisms of autophagy induction and bactericidal activity in muring bone marrow derived macrophages (BMDMs). MethodsMurine BMDMs were isolated and cultured in vitro.Then standard strain of E.coli was used to infect BMDMs and cellular autophagy levels and AMPK activation were detected.We next modulated functions of AMPK by pretreating cells with the specific agonist or antagonist of AMPK.Then cellular AMPK activation, autophagy levels and bactericidal activity were observed after E.coli infection. ResultsIn E.coli infected BMDMs,autophagy related molecules like LC3B and Beclin1 were upregulated,accompanied with elevated LC3Ⅱ/Ⅰratio.Phosphorylation of AMPK was also upregulated by E.coli treatment.Enhanced AMPK activity by its agonist leads to increased cellular autophagy and bactericidal activity,whereas inhibition of AMPK by its suppressor downregulated autophagy and dampened bactericidal activity. ConclusionAMPK and its related signaling pathway is required for anti-bacterial response in macrophage,which is dependent on its function in upregulating autophagy related molecules and inducing autophagy.

[中圖分類號(hào)]R446.63;Q813.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)06-0591-04

[收稿日期]2015-09-29[修回日期] 2015-10-10

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81202566)

doi:10.11659/jjssx.09E015136

Kewords: AMPK；murine bone marrow derived macrophages (BMDM)；antibacterial autophagy