劉小雙 蒲旭峰 歐世榮 楊蕊

HPLC法測(cè)定?；切苋パ跄懰崮z囊含量的臨床分析

劉小雙 蒲旭峰 歐世榮 楊蕊

目的建立測(cè)定?；切苋パ跄懰崮z囊含量的方法。方法采用KromasilC18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(80%磷酸調(diào)pH至3.5), 梯度洗脫, 檢測(cè)波長205 nm, 柱溫30℃, 流速1.2 ml/min, 進(jìn)樣量20 μl。結(jié)果牛磺熊去氧膽酸在0.0953～1.9050 mg/ml范圍內(nèi)與濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)；加樣回收率為99.93%, RSD=1.0%(n=9)。結(jié)論采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定牛磺熊去氧膽酸膠囊含量, 該方法簡便準(zhǔn)確、精密度和重復(fù)性良好, 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

?；切苋パ跄懰崮z囊含量；高效液相色譜法

牛磺熊去氧膽酸是熊膽汁的有效成分, 而且僅在熊膽汁酸中含有, 其化學(xué)名是2-｛[(3,5,7)-3α,7β-二羥基-24-氧代膽甾烷-24-基]氨基｝乙烷磺酸, 二水合物[1], 分子式為C26H45NO6S·2H2O, 分子量為535.74, 是目前發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)親水性最強(qiáng)的膽汁酸, 是熊去氧膽酸在膽汁中的生理活性形式。牛磺熊去氧膽酸具有溶解膽固醇結(jié)石和保護(hù)肝細(xì)胞等多項(xiàng)生理功能。?；切苋パ跄懰崮z囊由BruschettiniS.r.I.(意大利貝司迪大藥廠)研制,2006年以商品名滔羅特獲準(zhǔn)在中國銷售, 最新注冊(cè)證號(hào)為H20110233, 規(guī)格為250 mg×20粒/盒。臨床主要用于治療膽囊膽固醇結(jié)石、原發(fā)硬化性膽管炎、原發(fā)膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等[2-4]。牛磺熊去氧膽酸膠囊在國內(nèi)外的藥典中尚未見收載, 現(xiàn)采用HPLC測(cè)定?；切苋パ跄懰崮z囊的含量, 操作方便, 專屬性好, 結(jié)果準(zhǔn)確, 重現(xiàn)性良好, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料來源

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀 [Agilent1200G1311A四元泵, Agilent1200MWDG1365D檢測(cè)器, Agilentchemstation化學(xué)色譜工作站(B.04.02)]；電子分析天平：METTLERT OLEDOXS105(0.1/0.01 mg)；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1601型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海精科儀器有限公司)。

1.2 試藥 牛磺熊去氧膽酸鈉對(duì)照品(購自美國TRC公司,批號(hào)：T009200), 甲醇、乙腈均為色譜純(Sigma公司), 水為超純水；其他試劑試藥均為分析純；市售滔羅特?；切苋パ跄懰崮z囊(批號(hào)：0907、1165, 均由成都欣捷高新技術(shù)開發(fā)有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(80%磷酸調(diào)pH至3.5), 梯度洗脫(0 min,20%A；8 min,45%A；30 min,20%A)；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：205 nm, 流速1.2 ml/min, 進(jìn)樣量20 μl。在上述色譜條件下, 理論板數(shù)按?；切苋パ跄懰嵊?jì)算不得低于6000, 拖尾因子不得過2.0。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的牛磺熊去氧膽酸鈉鹽對(duì)照品10.47 mg(折合成?；切苋パ跄懰釣?0.01 mg)置于10 ml量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 搖勻得1.00 mg/ml?；切苋パ跄懰釋?duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取?；切苋パ跄懰崮z囊內(nèi)容物,混勻, 研細(xì), 精密稱取32.07 mg(約相當(dāng)于?；切苋パ跄懰?5.04 mg), 置于25 ml量瓶中, 加入甲醇20 ml, 超聲提取5 min, 放冷至室溫, 再加甲醇定容至刻度, 搖勻, 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾, 取續(xù)濾液作為?；切苋パ跄懰峁┰嚻啡芤骸?/p>

2.3 方法專屬性考察 取處方量輔料按2.2.2項(xiàng)下方法制備輔料空白溶液, 再采用2.1項(xiàng)色譜條件, 分別精密量取20 μl?；切苋パ跄懰釋?duì)照品溶液、供試品溶液、輔料空白溶液注入高效液相儀進(jìn)行測(cè)定, 記錄色譜圖, 結(jié)果空白輔料在與?；切苋パ跄懰釋?duì)照品峰相同的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn), 表明空白輔料對(duì)牛磺熊去氧膽酸樣品的檢測(cè)無干擾。見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)、供試品(B)、輔料空白(C)HPLC方法專屬性考察色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取?；切苋パ跄懰釋?duì)照品10.12 mg置于5 ml容量瓶中, 加甲醇溶解并稀釋至刻度, 作為對(duì)照品貯備液(2.02 mg/ml)。以進(jìn)樣濃度10%～200%的濃度范圍內(nèi)取6個(gè)濃度點(diǎn)(即10%、20%、50%、100%、120%、200%)進(jìn)行線性回歸。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得線性回歸方程：Y=4.593×106X+8788(r=0.9999), 表明?；切苋パ跄懰嵩?.0953～1.9050 mg/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下的?；切苋パ跄懰釋?duì)照品溶液20 μl連續(xù)進(jìn)樣5次, 測(cè)得5次峰面積RSD=0.42%(n=5), 說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)(1165)的樣品適量, 按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液, 平行操作6份, 在上述色譜條件下, 測(cè)得牛磺熊去氧膽酸平均含量為99.87% RSD=0.56%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)(1165)樣品6份, 按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液, 分別于配制后的0、2、4、8、24、48 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 記錄峰面積,?；切苋パ跄懰岱迕娣e在48 h內(nèi)RSD=0.18%, 結(jié)果表明牛磺熊去氧膽酸在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 按處方比例, 取低(80%)、中(100%)、高(120%)3個(gè)不同濃度的?；切苋パ跄懰釋?duì)照品, 分別加入處方量輔料, 混勻, 精密稱取適量(約相當(dāng)于?；切苋パ跄懰釋?duì)照品8、10、12 mg), 按2.2.2項(xiàng)下處理后, 進(jìn)樣20 μl, 記錄色譜圖。另取?；切苋パ跄懰釋?duì)照品儲(chǔ)備液, 同法測(cè)定,按外標(biāo)法計(jì)算,3種含量的樣品中?；切苋パ跄懰岬幕厥章史謩e為99.76%、99.81%、100.23%, 平均回收率為99.93%, RSD=0.26%。

2.9 樣品測(cè)定 分別精密量取20 μl牛磺熊去氧膽酸對(duì)照品溶液和供試品溶液, 按照2.1項(xiàng)色譜條件注入高效液相色譜儀, 記錄色譜圖, 按外標(biāo)法計(jì)算2批?；切苋パ跄懰崮z囊樣品的含量, 結(jié)果分別為標(biāo)示量的99.76%(0907)和99.83% (1165)。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中取?；切苋パ跄懰釋?duì)照品溶液在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描, 結(jié)果牛磺熊去氧膽酸僅有末端的紫外吸收,與張曉艷等[5]的研究一致, 考慮溶劑響應(yīng)的影響, 因此將205 nm作為檢測(cè)波長。

3.2 曾參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]甲醇0.05 mol/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào)節(jié)pH值4.5)(60：40)為流動(dòng)相, 峰形不理想, 經(jīng)比較, 采用本文流動(dòng)相?；切苋パ跄懰嶂鞣灞Ａ魰r(shí)間適中, 且峰形較滿意。試驗(yàn)結(jié)果顯示, 線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性等均能滿足用于?；切苋パ跄懰崮z囊含量的測(cè)定。

3.3 在采用HPLC法測(cè)定?；切苋パ跄懰岬暮繒r(shí), 多以?；切苋パ跄懰徕c作為對(duì)照品, 計(jì)算結(jié)果再折算到牛磺熊去氧膽酸的含量, 與高鵬[6]的研究一致。

[1]王海龍, 吳成龍, 鄧勇, 等.?；切苋パ跄懰岬暮铣?中國醫(yī)藥工業(yè)雜質(zhì),2009,40(2):88-89.

[2]沈俊, 周聃, 張若丹, 等. HPLC測(cè)定風(fēng)熱清膠囊中的綠原酸和牛磺熊去氧膽酸.華西藥學(xué)雜志,2008,23(3):346-348.

[3]駱助林, 陳理國, 苗建國, 等.保膽取石術(shù)后口服?；切苋パ跄懰犷A(yù)防結(jié)石復(fù)發(fā)的臨床觀察.中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2011,11(6):644-646.

[4]傅賢波, 林三仁, 范竹萍, 等.?；切苋パ跄懰崛芙饽懩夷懝檀冀Y(jié)石有效性和安全性—隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、多中心臨床研究.中國微創(chuàng)外科雜志,2007,7(12):1159-1163.

[5]張曉艷, 崔蕊, 賈建靜, 等. HPLC測(cè)定?；切苋パ跄懰崮z囊中的有關(guān)物質(zhì).華西藥學(xué)雜質(zhì),2012,27(5):585-587

[6]高鵬. HPLC法測(cè)定消痔軟膏中?；切苋パ跄懰岬暮?山東中醫(yī)雜志,2011,30(3):198-199.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.16.194

2015-03-24]

611137 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(劉小雙 蒲旭峰)；成都欣捷高新技術(shù)開發(fā)有限公司(歐世榮 楊蕊)