頸痹合劑的質(zhì)量標準研究

魏曉舒，劉 燕，張敏娟（1.江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇無錫 1408；.無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇無錫 14071）

頸痹合劑是無錫市中醫(yī)醫(yī)院自制制劑，由羌活、葛根、木香等多味中藥加工而成。該處方是成形的經(jīng)驗方，具有祛風除濕活血通絡(luò)的功效，適用于風寒濕痹為主的頸型和神經(jīng)根型頸椎病的治療[1-2]。根據(jù)難治性疾病中藥制劑的研發(fā)思路[3]，并且根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)制劑配制監(jiān)督管理辦法（試行）》[4]和《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法》[5]要求，本著確保特色制劑質(zhì)量、提升醫(yī)院制劑標準的宗旨，筆者采用薄層色譜（TLC）法對紫花前胡苷、去氫木香內(nèi)酯、葛根素進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對葛根的主要有效成分葛根素進行含量測定，并分析了制劑的相對密度、pH，為其質(zhì)量控制提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

1200 型HPLC 儀，包括紫外檢測器（美國Agilent 公司）；AG-285 型電子天平、XP-6 型電子天平、MP220 型pH 計（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

頸痹合劑（無錫市中醫(yī)醫(yī)院自制，批號：110302、110927、110928、120104、120105、120106，規(guī)格：500 ml/瓶）；葛根素對照品（批號：110752-200912，純度：96%）、去氫木香內(nèi)酯對照品（批號：111525-200505，純度＞98%）；紫花前胡苷對照品（批號：111821-201102，純度＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 羌活 取樣品20 ml，加乙醚振搖提取2 次（每次20 ml），合并乙醚液備用；水液加水飽和正丁醇振搖提取2 次（每次20 ml），合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。取紫花前胡苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 ml含0.5 mg的對照品溶液。按處方及制備工藝制備缺羌活的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按上述TLC 法[2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1A。

2.1.2 木香 取“2.1.1”項下乙醚液，低溫揮去乙醚，殘渣加三氯甲烷2 ml 使溶解，作為供試品溶液。取去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加三氯甲烷溶解制成每1 ml 含0.5 mg 的對照品溶液。按處方及制備工藝制備缺木香的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-甲苯-乙酸乙酯（2∶1∶1，V/V/V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1B。

2.1.3 葛根 取樣品30 ml，用氫氧化鈉調(diào)pH 至9～10，加乙酸乙酯振搖提取2次（每次20 ml），棄去乙酸乙酯液；水液加稀鹽酸調(diào)pH 至5～6，用乙酸乙酯振搖提取2 次（每次30 ml），合并提取液，經(jīng)無水硫酸鈉2 g濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。按處方及制備工藝制備缺葛根的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取葛根素對照品適量，加甲醇制成每1 ml 含0.5 mg 的對照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1C。

圖1 薄層色譜圖A.羌活[1、3、5.供試品（批號：120104、120105、120106）；2.陰性對照；4.對照品]；B.木香[1～3.供試品（批號：120104、120105、120106）；4.對照品；5.陰性對照]；C.葛根[1～3.供試品（批號：120104、120105、120106）；4.對照品；5.陰性對照]Fig 1 TLC chromatogramsA.Notopterygii Rhizoma et Radix[1.3.5.test samples（batch number：120104，120105，120106）；2.negative control；4.reference substance]；B.Aucklandia lappa[1-3.test samples（batch number：120104，120105，120106）；4.negative control；5.reference substance]；C.Pueraria lobata[1-3.test samples（batch number：120104，120105，120106）；4.negative control；5.reference substance]

2.2 相對密度和pH測定

按2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅧA 相對密度測定法比重瓶法測定樣品的相對密度。結(jié)果顯示，6批樣品的相對密度平均值為1.08，RSD 為0.6%（n＝6）。按2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅧG pH 測定法測定樣品pH。結(jié)果顯示，6 批樣品pH平均值為4.5，RSD為1.5%（n＝6）。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：XTer-ra?RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10μl。當信噪比為12∶1、3.9∶1時，葛根素定量限、檢測限分別為0.33、0.17 μg/ml。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以葛根素峰計應(yīng)不低于5 000，分離度應(yīng)不小于1.5，詳見圖2。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素對照品1.257、1.732 mg，用30%乙醇分別制成每1 ml 含葛根素0.120 7、0.166 3 mg 的對照品貯備液Ⅷ、Ⅷ。精密吸取對照品貯備液Ⅷ適量，用30%乙醇制成每1 ml 含葛根素6.034 μg 的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密吸取樣品5 ml，置于100 ml量瓶中，用30%乙醇定容，搖勻，靜置1 h，取上清液，濾過；精密吸取續(xù)濾液1 ml，置于10 ml 量瓶中，用30%乙醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖2 高效液相色譜圖A.陰性對照；B.對照品；C.供試品；1.葛根素Fig 2 HPLC chromatogramsA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.puerarin

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取不含葛根的其他藥味各適量，按頸痹合劑的制備工藝制成缺葛根的陰性樣品，再按“2.3.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項下葛根素對照品貯備液Ⅷ適量，用30%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為33.26、16.63、8.315、4.158、2.079 μg/ml的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.3.1”項下色譜條件進樣6次測定，記錄峰面積。以葛根素質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝44.048x－14.042（r＝0.999 8，n＝6）。結(jié)果表明，葛根素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.079～33.26 μg/ml。

2.3.6 精密度試驗 取“2.3.2”項下對照品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD為0.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.3”項下供試品（批號：110302）溶液適量，分別于放置0、3、6、9、12 h 時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD 為0.2%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：110302）適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素峰面積的RSD為0.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已含量的樣品（批號：110302）適量，共6份，分別加入一定量葛根素對照品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.3.10 樣品含量測定 取6 批樣品各適量，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

頸痹合劑屬多組分制劑，其中主藥羌活中紫花前胡苷、木香中去氫木香內(nèi)酯和葛根中葛根素均具有鑒別的特征性意義，而處方中其他藥材均不含這些特征成分[6]，因此選擇該三種成分進行TLC 鑒別。經(jīng)過對供試品溶液前處理、展開劑的選擇及顯色方式篩選，該色譜結(jié)果專屬性較強、斑點清晰、陰性對照無干擾，這對原藥材的質(zhì)量及制備工藝都起到了監(jiān)督作用。

有研究報道，HPLC測定頸痹顆粒中葛根素含量時流動相采用甲醇-水（25∶75，V/V）[7]。本研究的預(yù)試驗結(jié)果表明，針對以水為溶劑的供試品溶液，應(yīng)采用乙腈-水配比的流動相，用適量磷酸調(diào)節(jié)可使葛根素峰形對稱，清除雜峰能力增強，重現(xiàn)性較好。當水比例占很大部分時，不宜采用一般的ODS色譜柱，而利用屏蔽技術(shù)的XTerra?RP色譜柱有很好的水浸潤性，即便是使用100%的水溶液作為流動相，亦可獲得穩(wěn)定的色譜結(jié)果。2010 年版《中國藥典》（一部）規(guī)定：葛根藥材按干燥品計算，葛根素含量不得少于2.4%[8]，這為制定頸痹合劑中葛根素定量指標提供了參考依據(jù)，也給制備工藝提出了新要求。

綜上所述，該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于頸痹合劑的質(zhì)量控制。

[1]張興國，周文浩.頸痹合劑治療頸型及神經(jīng)根型頸椎病80 例臨床觀察[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2011，27（2）：263.

[2]吳震海.頸痹合劑治療頸型及神經(jīng)根型頸椎病的療效觀察[J].臨床合理用藥，2012，5（3A）：79.

[3]宋洪濤，張晶，周欣，等.當前醫(yī)院制劑發(fā)展策略與研發(fā)思路探討[J].中國藥房，2009，20（13）：999.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理局.醫(yī)療機構(gòu)制劑配制監(jiān)督管理辦法：試行[S].2005-06-01.

[5]國家食品藥品監(jiān)督管理局.醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法：試行[S].2005-08-01.

[6]肖培根.新編中藥志：第一卷[M].北京：化學工業(yè)出版社，2002：121.

[7]何建華，錢永昌，許勇.HPLC 測定痙痹顆粒中葛根素的含量[J].海峽藥學，2005，17（6）：81.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：313.