毛愛(ài)麗（鶴壁市食品藥品檢驗(yàn)所，河南鶴壁 458030）

清胃黃連丸是由黃連、桔梗、甘草、梔子、黃芩、赤芍、地黃、牡丹皮、知母、黃柏等14味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有清胃瀉火、解毒消腫之功效，臨床用于治療肺胃火盛所致的口舌生瘡、齒齦、咽喉腫痛[1]。2010 年版《中國(guó)藥典》（一部）收載了該制劑，并對(duì)制劑中黃連、黃柏所含的鹽酸小檗堿的含量測(cè)定進(jìn)行了規(guī)定[1]，但僅控制單一成分的含量很難保證復(fù)方制劑的質(zhì)量[2]。為了更好地對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，筆者參閱相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]，選擇了梔子、赤芍、黃連、黃柏、黃芩、牡丹皮6種中藥材中的5種主要成分進(jìn)行質(zhì)量分析，為提高清胃黃連丸的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C 型高效液相色譜（HPLC）儀，包括UV-240 型分光光度計(jì)（日本島津公司）；AE 240 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；SC-3610 型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

清胃黃連丸（山西旺龍神農(nóng)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20140706、20140908、20141110，規(guī)格：9 g/袋）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-200609，純度：98.1%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-200506，純度：100%）；梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201115，純度：99.7%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-200413，純度：100%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201337，純度：94.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純，水為純化水。

1.3 飲片

黃連、桔梗、甘草、梔子、黃芩、赤芍、地黃、牡丹皮、知母、黃柏、連翹、石膏、天花粉、玄參飲片均購(gòu)于鶴壁市天寶醫(yī)藥連鎖有限責(zé)任公司總店，批號(hào)：20150312）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.3%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，12%A；10～22.5 min，12%→14%A；22.5～23 min，14%→24%A；23～38 min，24%A；38～38.5 min，24%→38%A；38.5～55 min，38%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，各成分基線分離良好。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.缺梔子的陰性對(duì)照；D.缺赤芍、牡丹皮的陰性對(duì)照；E.缺黃柏、黃連的陰性對(duì)照；F.缺黃芩的陰性對(duì)照；1.梔子苷；2.芍藥苷；3.鹽酸小檗堿；4.黃芩苷；5.丹皮酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control without Gardenia jasminoides；D.negative control without Radix paeoniae and Cortex moutan；E.negative control without Cortex phellodendri and Coptis chinensis；F.negative control without Scutellaria baicalensis；1.geniposide；2.paeoniflorin；3.berberine hydrochloride；4.baicalin；5.paeonol

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液 精密稱取梔子苷對(duì)照品30.82 mg、芍藥苷13.83 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品46.36 mg、黃芩苷對(duì)照品52.13 mg、丹皮酚對(duì)照品11.14 mg，置于同一100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.308 2、0.138 3、0.463 6、0.521 3、0.111 4 mg/ml的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，粉碎，過(guò)3 號(hào)篩，取細(xì)粉，精密稱取0.5 g置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 ml，精密稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）提取20 min，密閉放置4 h，加熱回流30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以半徑為16 cm、3 000 r/min 離心5 min，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按清胃黃連丸的處方和制備工藝分別制備缺黃柏、黃連、梔子、黃芩、赤芍、牡丹皮的單一陰性對(duì)照樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液5.0 ml，共5份，分別置于10、25、50、50、100 ml量瓶中，加流動(dòng)相定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚回歸方程分別為y＝15 209x－1 157（r＝0.999 8）、y＝13 377x－166 507（r＝0.999 9）、y＝38 995x－53 991（r＝0.999 8）、y＝13 526x－16 417（r＝0.999 9）、y＝20 310x－3 885（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為15.36～153.6、6.56～65.6、22.74～227.4、26.06～260.6、5.57～55.7 μg/ml。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.5%、0.6%、0.3%、0.4%、0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：20140706）適量，分別于放置0、2、4、8、12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.6%、0.8%、0.7%、0.6%、1.0%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20140706）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.6%、0.7%、0.4%、0.5%、0.7%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140706）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

筆者取梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚對(duì)照品各適量，分別用甲醇溶解，在分光光度計(jì)200～400 nm 波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果5種成分的最大吸收各不相同，分別在238、230、229、278、275 nm濃長(zhǎng)處。其中，在238 nm波長(zhǎng)處為梔子苷的最大吸收，而且其他成分在該波長(zhǎng)處均有較好的吸收，故選擇238 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝4，mg/g）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝4，mg/g）

筆者對(duì)不同的提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間、提取溶劑體積的測(cè)量依次進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以甲醇為溶劑，先超聲提取20 min，冷浸4 h 后再加熱回流30 min 可提取完全，效果最佳。

由于待測(cè)成分多，本試驗(yàn)采用梯度洗脫方法，分別選擇甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸鹽溶液，并參照有關(guān)文獻(xiàn)[8-11]，經(jīng)過(guò)優(yōu)化洗脫條件，最終選擇了峰形與分離效果均好的乙腈-0.3%磷酸系統(tǒng)。

赤芍和牡丹皮均含有丹皮酚、芍藥苷[3]，筆者以HPLC法測(cè)定為總丹皮酚、芍藥苷含量；黃連、黃柏中均含鹽酸小檗堿[1]，試驗(yàn)中所測(cè)鹽酸小檗堿為總鹽酸小檗堿含量。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，適用于清胃黃連丸中梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚的含量測(cè)定。

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