劉建萍，陳 濤（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

腦血栓丸（制劑批準(zhǔn)文號(hào)：津藥制字Z20070720號(hào)）是我院臨床使用多年的醫(yī)院制劑。該制劑由赤芍、當(dāng)歸、丹參、水蛭等11味中藥組成，具有鎮(zhèn)肝清心、活血通絡(luò)的功效，臨床主要用于腦血栓形成急性期促進(jìn)肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，療效確切。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別，而無(wú)有效成分含量測(cè)定。為更好地控制該制劑的質(zhì)量、縮短檢測(cè)時(shí)間，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)對(duì)其主藥赤芍、當(dāng)歸的有效成分芍藥苷和阿魏酸[1-2]的含量進(jìn)行了測(cè)定，以為后期研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

600E型HPLC儀，包括2998二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；AG135 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

腦血栓丸（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，批號(hào)：121122、130520、131028，規(guī)格：9 g/丸）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：121093-200402）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：111703-200501）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈、冰乙酸均為色譜純，甲醇、乙醚、正丁醇等均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果[3-9]

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunfireTMC18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-冰乙酸（17∶82∶1，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取芍藥苷和阿魏酸對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml 含0.60 mg 芍藥苷和0.47 mg阿魏酸的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品4 g，剪碎，精密稱定，加甲醇50 ml，索氏提取法提取4 h；提取液回收甲醇并用水浴蒸干，殘?jiān)訜崴?0 ml使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中；用乙醚提取3 次，每次20 ml，合并乙醚提取液，水浴蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解并稀釋至5 ml；水溶液繼續(xù)用水飽和正丁醇提取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解并稀釋至10 ml。精密量取乙醚層溶液3 ml 和正丁醇層溶液1 ml，置于5 ml棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取不含赤芍和當(dāng)歸藥材的其他藥味，按腦血栓丸的制備工藝制備成缺二者的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入HPLC儀，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，供試品色譜中在與混合對(duì)照品色譜芍藥苷和阿魏酸峰相應(yīng)保留時(shí)間處有相同色譜峰，而陰性對(duì)照在此保留時(shí)間處無(wú)干擾；并且芍藥苷和阿魏酸峰與相鄰峰分離度均符合要求，表明處方中其他成分對(duì)這2個(gè)成分含量測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.芍藥苷；2.阿魏酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；2.ferulic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml的芍藥苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度0.60 mg/ml），0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 ml的阿魏酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度0.47 mg/ml），分別置于5 ml 棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，分別制備成0.024、0.060、0.120、0.180、0.240 mg/ml的芍藥苷系列對(duì)照品溶液和0.009 4、0.018 8、0.047 0、0.094 0、0.141 0 mg/ml 的阿魏酸系列對(duì)照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為y＝3.00x－1.58（r＝0.999 9），阿魏酸的回歸方程為y＝1.12x－1.72（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，芍藥苷與阿魏酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.024～0.240、0.009 4～0.141 0 mg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取芍藥苷質(zhì)量濃度為0.060 mg/ml 和阿魏酸質(zhì)量濃度為0.018 8 mg/ml 的混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.37%、1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：131028）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于25 ℃下放置0、2、4、8、12、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD 分別為1.76%、1.62%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：131028）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD 分別為1.57%、1.49%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取芍藥苷對(duì)照品6.20 mg和阿魏酸對(duì)照品3.40 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，備用。稱取已知含量的腦血栓丸（批號(hào)：131028，含芍藥苷0.308 mg/g、阿魏酸0.171 mg/g）樣品6 份，每份2 g，精密稱定，分別加入上述混合對(duì)照品溶液1 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批腦血栓丸各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算芍藥苷和阿魏酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本試驗(yàn)考察了超聲提取、回流提取和索氏提取3種提取方法，結(jié)果表明索氏提取效果較好，不但含量較高，而且峰形和分離度也較好。故最終確定芍藥苷和阿魏酸的提取方法為索氏提取法。

3.2 提取溶劑、次數(shù)的選擇

筆者以有效成分的含量、峰形、分離度為考察指標(biāo)，考察了石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇等不同提取溶劑組合。結(jié)果表明，乙醚-水飽和正丁醇組合提取成分較完全，峰形和分離度較好。此外，筆者還對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行了考察，分別考察了提取2、3、4次有效成分含量。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，有效成分含量隨之增加，但是增加的幅度逐漸變小，考慮檢測(cè)時(shí)間和成本，以乙醚、水飽和正丁醇分別提取3次為宜。

3.3 流動(dòng)相的選擇

采用乙腈-水-冰乙酸的體系，選用不同配比進(jìn)行試驗(yàn)，充分考慮峰形，二主成分峰出峰間隔時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸（17∶82∶1，V/V/V）。

3.4 柱溫的選擇

先后在25、30、35、40 ℃下進(jìn)樣測(cè)定，其中35 ℃柱溫條件下分離較好，且峰形對(duì)稱，峰面積大小較為穩(wěn)定，最終確定柱溫為35 ℃。

3.5 波長(zhǎng)的選擇

芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)為230 nm，阿魏酸為316 nm。芍藥苷在316 nm 下幾乎無(wú)吸收，而阿魏酸在230 nm 下吸收較大。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)表明，供試品在230 nm和316 nm下測(cè)定的阿魏酸含量基本一致。故最終測(cè)定波長(zhǎng)選擇230 nm。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，可用于腦血栓丸的質(zhì)量控制。

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