邰順章，袁步娟，鞏克民，張婷婷（.鹽城市藥品檢驗(yàn)所，江蘇鹽城 400；.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城 4006）

妥布霉素地塞米松滴眼液為混懸型滴眼劑，可用于治療各種急慢性結(jié)膜炎、外周性角膜炎、淚囊炎、化學(xué)灼傷，及預(yù)防各種眼部手術(shù)后感染。妥布霉素為氨基糖苷類抗菌藥物，是一種無(wú)紫外吸收的化合物，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用抗生素微生物檢定法[1-3]和高效液相色譜（HPLC）衍生化法[4-6]測(cè)定其含量；同時(shí)也有采用旋光法、衍生化紫外分光光度法、HPLC-ELSD 法和薄層色譜定量法等測(cè)定其含量的文獻(xiàn)報(bào)道[7-16]。地塞米松為糖皮質(zhì)激素類藥物，在甲醇中略溶，在水中幾乎不溶，有紫外吸收，具旋光性，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)多采用HPLC法測(cè)定其含量[1-6]。目前，該制劑尚未見采用紫外檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定2 種主成分含量的報(bào)道。為快捷、有效控制妥布霉素地塞米松滴眼液的質(zhì)量，本試驗(yàn)對(duì)采用HPLC-柱前衍生化-雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定該制劑中2種主成分含量的方法進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型HPLC 儀，包含CTO-20A 型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、LC-20AB 型真空脫氣機(jī)、SIL-20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器和LC-20A色譜工作站（日本島津公司）；XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

妥布霉素地塞米松滴眼液（杭州國(guó)光藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140312、140315、140708；齊魯制藥有限公司，批號(hào)：131163PG、140623PG、140671PG，規(guī)格均為5 ml中含妥布霉素15 mg 和地塞米松5 mg）；妥布霉素對(duì)照品（批號(hào)：130527-200402，純度：91.4%）、地塞米松對(duì)照品（批號(hào)：100129-201105，純度：99.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三羥甲基氨基甲烷（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100925）；2，4-二硝基氟苯（分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：201203211）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司，批號(hào)：142605）；乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA 公司，批號(hào)：1205078）；其他化學(xué)試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.25%三羥甲基氨基甲烷-乙腈-0.5 mol/L硫酸（40∶59∶1，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)365、220 nm（在檢測(cè)過程中切換波長(zhǎng)：0～3.5 min檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm，3.5～6.0 min檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取妥布霉素對(duì)照品49.26 mg和105 ℃干燥2 h 的地塞米松對(duì)照品15.06 mg，置于50 ml 量瓶中，加水適量和0.5 mol/L 硫酸1 ml 使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml 量瓶中，各加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml 和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液 取本品適量，搖勻后精密量取3 ml，置于100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，各加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 精密量取水10 ml，置于50 ml量瓶中，加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml 和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性和陰性干擾試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μl，注入HPLC 儀測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1 可見，供試品溶液與對(duì)照品溶液中妥布霉素和地塞米松色譜峰保留時(shí)間一致，理論塔板數(shù)以妥布霉素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度大于3.0。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照；B.對(duì)照品；C.供試品；1.妥布霉素；2.地塞米松Fig 1 HPLC chromatogramsA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.tobramycin；2.dexamethasone

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1、3、5、7、10 ml，置于50 ml 量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備系列對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得妥布霉素回歸方程為y＝2.570 1×104x－1.198 59×105（r＝0.999 5），地塞米松回歸方程為y＝8.581 8×104x－2.219 81×105（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，妥布霉素、地塞米松檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為18.01～180.09、6.02～60.24 μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，妥布霉素和地塞米松峰面積的RSD 分別為0.59%、0.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：140312）適量，分別于室溫（25 ℃）下放置0、3、6、9、12、15 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，妥布霉素和地塞米松峰面積的RSD 分別為0.74%、0.62%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為140312 的樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果，妥布霉素和地塞米松含量的RSD分別為0.67%、0.22%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已含量的樣品（批號(hào)：140312）3 ml，置于100 ml量瓶中，共9 份，每3 份一組分別加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液8、10、12 ml，混合后按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理和制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算2種主成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝2）

3 討論

妥布霉素是一種無(wú)紫外吸收的化合物，采用HPLC紫外檢測(cè)法時(shí)需用2，4-二硝基氟苯和三羥甲基氨基甲烷進(jìn)行柱前衍生化，而樣品中地塞米松不與衍生化試劑反應(yīng)，柱前衍生化對(duì)測(cè)定地塞米松含量無(wú)影響。

本試驗(yàn)曾分別用乙腈-水（45∶55，V/V）、甲醇-水（45∶55，V/V）、0.25%三羥甲基氨基甲烷溶液-乙腈-0.5 mol/L硫酸溶液（40∶59∶1，V/V/V）作流動(dòng)相進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以0.25%三羥甲基氨基甲烷溶液-乙腈-0.5 mol/L 硫酸溶液（40∶59∶1，V/V/V）為流動(dòng)相體系時(shí)，分離效果較好，能實(shí)現(xiàn)對(duì)妥布霉素和地塞米松的有效洗脫，且可排除溶劑峰對(duì)測(cè)定的影響。

本試驗(yàn)曾分別在240、220 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定地塞米松的含量。結(jié)果表明，在240 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，信號(hào)較強(qiáng)，產(chǎn)生信號(hào)超載，供試品溶液不能在本方法條件下同時(shí)測(cè)定2 種組分含量；而在220 nm 波長(zhǎng)處信號(hào)較合適。故選用220 nm 波長(zhǎng)測(cè)定地塞米松的含量。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便省時(shí)、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于妥布霉素地塞米松滴眼液的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）：YBH02182004[S].2004.

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)：YBH11782005[S].2005.

[3]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)：YBH11782006[S].2006.

[4]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）：WS-224（X-197）-2000[S].2000.

[5]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)：YBH02582007[S].2007.

[6]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)：YBH00112008[S].2008.

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