張正鋒，石 克（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

現(xiàn)代中藥生產(chǎn)過程中常用的滅菌方法有濕熱、超濾、微波、60Co輻照滅菌法等。其中，60Co輻照滅菌法由于方便、高效等特點而逐步得到關(guān)注和重視，大量用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的最終滅菌。衛(wèi)生與計劃生育委員會于1997 年發(fā)布了《60Co 輻照中藥滅菌劑量標準（內(nèi)部試行）》，該標準規(guī)定，丸劑輻照劑量不得大于5 kGy，并列出了可輻照和不可輻照的部分中藥材和中成藥品種，為60Co輻照滅菌的應用提供了依據(jù)。藿膽丸為該標準中明確規(guī)定可輻照的中成藥。近年來大量研究表明，輻照劑量過大，對某些藥品的某些成分可能會造成影響甚至破壞[1-2]。由于中藥是多組分協(xié)同作用發(fā)揮藥效，一種或幾種成分的改變，將可能影響藥品安全、有效。有眾多文獻報道了60Co輻照滅菌對中藥成分的影響[3-8]，但大多只針對個別典型成分進行考察，由于中藥成分的復雜性，通過個別成分的考察很難說明問題。有研究曾嘗試用高效液相色譜指紋圖譜技術(shù)分析中藥提取物輻照滅菌前后成分變化[9]，但結(jié)果不理想。而目前對輻照前后中藥中多個揮發(fā)性組分同時評價的方法，筆者還未見文獻報道。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，對藿膽丸中百秋李醇等多個揮發(fā)性組分的含量變化進行分析，以判定不同劑量60Co輻照對藿膽丸中百秋李醇等揮發(fā)性成分的含量的影響，為藿膽丸60Co輻照滅菌的可行性及其輻照劑量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890型氣相色譜儀（GC），包括7000型質(zhì)譜（MS）檢測器、Mass hunter 工作站（美國Agilent 公司）；MSU224S-100-DU 型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

藿膽丸（廣州市藥品檢驗所，批號：130401、130402、130403）；百秋李醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110772-200404，純度＞98%）；試驗所用試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的處理

取樣品粉末100 g，分別置0、3、6、8、10、25 kGy60Co 輻照劑量下照射，得到經(jīng)過不同劑量單次輻照的樣品（依次編號為1、2、3、4、5、6）。取經(jīng)過3、6、8、10 kGy60Co輻照劑量照射的樣品粉末50 g，再分別置10 kGy60Co 輻照劑量下照射，得到經(jīng)過重復輻照處理的樣品（依次編號為7、8、9、10）。

2.2 試驗條件

2.2.1 GC 條件 色譜柱：HP-5MS；程序升溫（初始溫度120 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；再以8 ℃/min升至250 ℃，保持3 min）；進樣口溫度：250 ℃；分流進樣，分流比：50∶1；檢測器：三重四級桿MS 檢測器；載氣：氦氣；流速：1.2 ml/min；進樣量：1μl。

2.2.2 MS條件 離子源：電子轟出；轟擊能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍：50～500 amu；MS1四級桿溫度：150 ℃，MS2四級桿溫度：150 ℃。在上述試驗條件下，各成分基線分離良好，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取百秋李醇對照品約10 mg，置于10 ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，即得。

圖1 氣相色譜-質(zhì)譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.β-百秋李烯；2.α-愈創(chuàng)木烯；3.塞舌爾烯；4.α-百秋李烯；5.α-布藜烯；6.5，11-愈創(chuàng)木二烯；7.百秋李醇；8.未鑒定物Fig 1 GC-MS chromatogramsA.reference substance；B.test samples；C.negative control；1.β-patchoulene；2.α-guaiene；3.seychellene；4.α-patchoulene；5.α-bulnesene；6.5，11-guaiadiene；7.patchouli alcohol；8.no identification

2.3.2 供試品溶液 取樣品細粉約2 g，精密稱定，置于250 ml圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油測定器，測定器上端加水使刻度充滿，再加乙酸乙酯2 ml，連接回流冷凝管，緩緩加熱至沸騰，并保持微沸2 h，放冷，分取乙酸乙酯液。用少量乙酸乙酯洗滌揮發(fā)油提取器，合并乙酸乙酯液，并迅速以盛有少量無水硫酸鈉的漏斗濾過，濾液置于10 ml 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液 按藿膽丸的處方和制備工藝制備缺廣藿香葉的陰性對照品，再按“2.3.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取百秋李醇對照品20.62 mg，置于10 ml 量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，得質(zhì)量濃度為2.062 0 mg/ml的對照品溶液，倍比稀釋成質(zhì)量濃度為1.031、0.414 2、0.206 2、0.103 1 mg/ml的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各1 μl，按“2.2”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以百秋李醇進樣量（x，μg）為橫坐標、（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝3.687 6×106x+5.163 0（r＝0.999 4，n＝5）。結(jié)果表明，百秋李醇檢測進樣量線性范圍為0.103 1～2.062 0μg。

2.5 精密度試驗

取“2.3.1”項下對照品溶液適量，按“2.2”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD為0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液（批號：130401，編號：1）適量，分別于放置0、4、8、12、18、24 h 時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD 為0.7%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：130401，編號：1）適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD為0.6%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：130401，編號：1）適量，共9 份，分別加入高、中、低質(zhì)量的百秋李醇對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下試驗條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定[10]

取30 批次樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下試驗條件進樣測定，根據(jù)樣品的MS全掃描圖，并結(jié)合文獻報道，用標準譜庫進行檢索，選取樣品中相對含量（以測定物與百秋李醇峰面積之比）≥1%且相似度≥90%的8個成分進行鑒定（其中8號峰相對含量較高但譜庫中沒有檢索到相似度高的化合物信息，且未見文獻報道，故暫未對其進行鑒定），并計算百秋李醇含量和其他7 個化合物的相對含量，結(jié)果見表2、表3。

表2 百秋李醇含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of the contents determination of patchouli alcohol（n＝3，mg/g）

表3 其余化合物的相對含量測定結(jié)果（n＝3，批號：130401）Tab 3 Results of the relative contents determination of compounds（n＝3，batch number：130401）

由表2、表3 可知，3 個批號的霍膽丸樣品經(jīng)不同劑量60Co輻照后百秋李醇含量不隨輻照劑量的增加而發(fā)生明顯變化。未經(jīng)輻照的樣品與經(jīng)過不同劑量輻照的樣品色譜圖進行比較，其中部分成分含量有極小的差異，可能因為含量太低或操作誤差導致。批號為130402、130403 的樣品與批號為130401的樣品上述7 個化合物相對含量測定結(jié)果變化趨勢相差不大。由此可見，輻照劑量對霍膽丸中易揮發(fā)組分影響不大。

3 討論

筆者曾參考2010年版《中國藥典》（一部）廣藿香藥材的含量測定方法[11]，用三氯甲烷超聲處理。該方法操作煩瑣，所得提取液顏色很深，且含較多不易揮發(fā)的組分，對GC-MS系統(tǒng)污染較大。本試驗采用水蒸氣蒸餾提取，所得供試液顏色較淺，提取的成分雖不及三氯甲烷超聲提取的多，但均為易揮發(fā)的組分，不易污染色譜系統(tǒng)。

輻照作為一種簡單高效的滅菌技術(shù)，已大量應用于食品加工行業(yè)，其優(yōu)勢是不用加熱，可對含熱不穩(wěn)定組分和揮發(fā)性組分較多的樣品進行滅菌，在中藥材貯藏和中藥制劑的生產(chǎn)中也應用較多。但是輻照可能對中藥中有效成分產(chǎn)生影響，因此應將輻照滅菌效果和導致藥物成分改變這兩個因素進行綜合考慮，以確定最佳輻照劑量。本試驗雖證實輻照劑量對霍膽丸中易揮發(fā)組分影響不大，但也不宜對霍膽丸的生產(chǎn)采取無控制的輻照滅菌，應該參照食品輻照劑量的國家標準，在綜合考慮滅菌效果的同時，盡量降低輻照劑量。

綜上所述，藿膽丸可采取60Co輻照滅菌，但應控制輻照劑量。該方法操作簡便、重復性好，可用于藿膽丸中揮發(fā)性成分含量的測定。

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