肖高春，童仕倫，鄭勇斌，郝志楠，李盛波

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科，湖北武漢430060）

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多個信號通路的異常活化，并參與腫瘤的進(jìn)展。其中研究較為廣泛的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）／絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine kinase，AKT）與絲裂原細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）／細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路也發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中異常活化，且其異?；罨梢种颇[瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與生存，在腫瘤中起重要作用，并參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。近來有研究顯示，該信號通路不僅參與腫瘤的進(jìn)展，同時也影響腫瘤的血管生成。PI3K是一種具有催化活性的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白，其可以調(diào)控下游的AKT磷酸化水平，二者共同構(gòu)成PI3K／AKT信號通路[2]，此信號通路可在多種類型細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮調(diào)控作用[3-4]。Lelievre等[5]研究表明，PI3K信號通路中的p110亞單位不僅能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和屏障功能，同時對血管形成也有重要作用。且血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ras基因持續(xù)活化能直接調(diào)節(jié)PI3K信號通路，誘導(dǎo)腫瘤血管畸變。

MEK／ERK信號通路是將細(xì)胞表面受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，控制著細(xì)胞多種生理過程，參入細(xì)胞的增殖、遷移與分化。內(nèi)皮細(xì)胞在新生血管形成過程中需要MEK／ERK信號通路的激活[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK和MEK分子期中的一個，都具備有抗新生血管生成的作用，表明MEK／ERK通路中的信號分子能為治療新生血管相關(guān)疾病提供合理的靶向分子[7]。任萱等[8]研究表明，ERK信號分子可能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移而影響新生血管的生成。目前以上述兩信號通路為靶點的治療備受關(guān)注。但對這兩條信號在結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用研究尚少見報道，本實驗通過PI3K／AKT信號通路抑制劑LY294002，MEK／ERK信號通路抑制劑PD98059，來研究兩信號通路在結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移種的作用及機(jī)制，為抗腫瘤新生血管形成治療提供實驗依據(jù)，尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）來自武漢大學(xué)消化實驗室保存，人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO（武漢大學(xué)保藏中心），PD98059，LY294002購自碧云天公司，胎牛血清購自Gibco公司，DMEM-F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、Transwell小室購自Corning公司，鼠尾膠購自Sigma公司，倒置相差顯微鏡日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 實驗分為8組，其中PI3K／AKT信號通路干預(yù)3組，使用2.50、7.50、15.00μmol／L的LY294002干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K／AKT信號通路；MEK／ERK信號通路干預(yù)3組，使用2.50、7.50、15.00μmol／L的PD98059干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的MEK／ERK信號通路（抑制劑使用濃度依據(jù)預(yù)實驗中確定的兩抑制劑的IC50來確定）；含0.10%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基組（DMSO組用來檢測溶解LY294002和PD98059的溶劑DMSO對內(nèi)皮細(xì)胞的功能的影響）；使用DMEM-F12培養(yǎng)基組（DMEM-F12組）作為對照組，每組設(shè)一復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC于37℃、5%CO2培養(yǎng)，每2～3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞80.00%左右融合時傳代培養(yǎng)。

1.2.3 LOVO培養(yǎng)上清液收集 參照文獻(xiàn)[9]方法將LOVO細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞80%左右融合的時，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，加入5mL無血清的DMEM-F12繼續(xù)培養(yǎng)，48h后收集上清液，用0.22μm的濾膜過濾，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞制備 取對數(shù)期生長的HUVEC，用含體積分?jǐn)?shù)為50%LOVO細(xì)胞上清液的DMEM-F12培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞80%左右融合時收集細(xì)胞，即為腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)（Td-EC）[9]，具有腫瘤血管的特性，并可以傳代培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗 參照文獻(xiàn)[10]方法取對數(shù)期生長的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液3.50×105個／孔，接種于預(yù)先做好刻度的6孔板（在6孔板背面每隔0.50cm做一刻度線，共5條刻度線），輕輕震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，待細(xì)胞80%左右融合時換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，同步化處理。在各孔內(nèi)用200μL槍頭做一垂直于刻度線的劃痕，劃去細(xì)胞并用PBS洗除漂浮細(xì)胞后。各組按前述分組處理，再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞30h后分別測量5條標(biāo)記線處的最大遷移距離，取5個位點的平均值作為一次測量值。細(xì)胞遷移距離＝測量距離（0h）-測量距離（30h），以μm作為計量單位。

1.2.6 定向遷移實驗 取12孔板每孔放兩個8mm×8mm的克隆環(huán)，緊密排列，固定于板底，兩孔內(nèi)分別加入2.5×104個Lovo細(xì)胞和對數(shù)期生長的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，待腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞80%左右融合時，用無血清培養(yǎng)基同步化處理24h后，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗后，各組內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)內(nèi)按前述分組處理。LOVO細(xì)胞繼續(xù)用含10%的胎牛血清培養(yǎng)基。12h后吸出兩克隆環(huán)內(nèi)的液體，并取出克隆環(huán)，PBS清洗，各孔內(nèi)加入2.5mL DMEM-F12完全培養(yǎng)基。以此時為0h，利用兩細(xì)胞團(tuán)邊緣細(xì)胞遷移距離為測量方法，再培養(yǎng)30h后測量兩細(xì)胞團(tuán)邊緣間最近細(xì)胞間距離，細(xì)胞定向遷移距離＝測量距離（0 h）-測量距離（30h），以μm作為計量單位。

1.2.7 Transwell遷移實驗 實驗中采用6.50mm 直 徑，10 μm厚度，8μm孔徑的聚碳酸酯多孔濾膜。將Transwell小室用1mg／mL的鼠尾膠包被。取200μL Sigma鼠尾膠原蛋白（5mg／mL）加入置入冰浴的離心管中，加入690μL H2O。然后加入到12μL 0.10mol／L NaOH中立即混勻，再加入100 μL 10×PBS培養(yǎng)液，混勻后立即以每孔50μL加入Transwell小室，輕輕震蕩，使其均勻平鋪在小室膜上，將小室室溫（25℃左右）下放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。使用前加入200μL DMEM-F12培養(yǎng)液預(yù)平衡。取各組處理后的對數(shù)期生長的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞2×105個與無血清培養(yǎng)基200μL加入上室，下室內(nèi)加入600μL含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定20min，自然晾干后用0.20%結(jié)晶紫染色15min，用脫脂棉擦除小室上表面的細(xì)胞，PBS清洗后，取小室放于載玻片上，在倒置相差顯微鏡（×100倍）上取上、下、左、右、中五個視野拍片計數(shù)，計算5個視野的平均值為穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗檢測比較 細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗檢測PI3K／AKT及MEK／ERK信號通路在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用，結(jié)果顯示，DMSO組與DMEM-F12組比較，遷移距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），小劑量DMSO對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的水平遷移功能無影響；PD98059、LY294002處理組細(xì)胞遷移受抑制，遷移距離明顯小于DMEM-F12組（P＜0.05），且隨著抑制劑濃度的增大，抑制越明顯，兩抑制劑對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響有濃度相關(guān)性；兩抑制劑之間比較，同等濃度的LY294002對細(xì)胞水平遷移的影響比PD98059明顯，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。LY294002對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響較PD98059強(qiáng)，且隨著抑制劑濃度增大，細(xì)胞遷移距離越短，同濃度的抑制劑LY294002組較PD98059組間距更大，見圖1A、B。

2.2 組間細(xì)胞定向遷移實驗檢測比較 定向遷移實驗檢測PI3K／AKT及MEK／ERK信號通路在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用，結(jié)果顯示，DMSO組與DMEM-F12組遷移距離比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），小劑量DMSO對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移功能無影響；PD98059、LY294002處理組腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移受抑制，與DMEM-F12組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著抑制劑濃度的增大，抑制越明顯，各亞組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩抑制劑對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響均與濃度呈正相關(guān)；兩抑制劑間比較，同等濃度的LY294002對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移的抑制作用較PD98059強(qiáng)，二者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。且隨抑制劑濃度的增大，兩細(xì)胞團(tuán)間的距離也越大，同等濃度的抑制劑，LY294002組較PD98059組間距大，見圖1C、D。

圖1 PD98059與LY294002處理后30h細(xì)胞刊痕、定向遷移及細(xì)胞遷移圖像

2.3 組間細(xì)胞Transwell遷移實驗檢測比較 Transwell遷移實驗檢測PI3K／AKT及MEK／ERK信號通路在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用，結(jié)果顯示，DMSO組與DMEM-F12組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），小劑量DMSO對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞垂直遷移無影響；PD98059、LY294002處理組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯小于DMEM-F12組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩抑制劑能抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞垂直遷移；隨著抑制劑濃度的增大，遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），抑制劑對細(xì)胞遷移能力的影響與濃度呈正相關(guān)；兩抑制劑間比較，同等濃度的LY294002處理組穿膜細(xì)胞數(shù)較PD98059處理組少，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LY294002對細(xì)胞垂直遷移的抑制作用較PD98059強(qiáng)（表1）。隨著抑制劑濃度增大，穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少，同等濃度的抑制劑LY294002組較PD98059組穿膜細(xì)胞少，見圖1E、F。

表1 組間細(xì)胞劃痕修復(fù)及定向遷移距離等比較（±s）

表1 組間細(xì)胞劃痕修復(fù)及定向遷移距離等比較（±s）

a：P＜0.05，與DMEM-F12、DMSO組比較；b：P＜0.05，與PD98059組相同劑量比較；c：P＜0.05，與同組2.50μmol／L比較；d：P＜0.05，與同組7.50μmol／L比較。

366.24±13.22 630.60±19.55 472.33±11.83 DMSO組 359.96±14.26 638.76±23.88 475.67±17.75 LY294002組2.50μmol／L 262.14±23.63ab 474.30±14.88ab 331.50±17.52ab 7.50μmol／L 208.41±23.08abc 385.11±16.80abc 277.17±13.96abc 15.00μmol／L 124.12±27.44abd 311.62±20.69abd 219.50±20.82abd PD98059組2.50μmol／L 295.44±14.10a 515.41±20.81a 372.00±15.71a 7.50μmol／L 256.00±15.16ac 440.89±18.62ac 313.00±24.29ac 15.00μmol／L 204.19±15.01ad 386.18±16.72ad 271.12±16.10組別 劃痕遷移距離 定向遷移距離 遷移細(xì)胞數(shù)DMEM-F12組ad

3 討論

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤，在中國消化道腫瘤中排第3位，且其發(fā)病率近年有明顯增高趨勢。結(jié)腸癌的治療，目前以手術(shù)治療作為首選，輔以化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療、靶向治療、中藥治療等。雖然結(jié)腸癌的治療方法很多，但結(jié)腸癌的總體治愈率近年來并沒有顯著的提高，而隨著對結(jié)腸癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移的深入研究，發(fā)現(xiàn)無論是在轉(zhuǎn)移的起始還是終末階段，血管生成均發(fā)揮著重要作用。因腫瘤的生長分為無血管期和血管期，當(dāng)腫瘤體積超過1mm3時腫瘤即進(jìn)入血管期，其生長必需依靠新生血管維持營養(yǎng)供給和排泄代謝產(chǎn)物。如果沒有新生血管生成，腫瘤就會保持休眠狀態(tài)甚至發(fā)生退化。然而腫瘤血管的生成是一持續(xù)、無控性過程，這種持續(xù)無規(guī)則的血管形成可以促進(jìn)腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。多條信號通路涉及到該過程，有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號途徑在血管發(fā)育的過程中起著重要作用，可直接影響血管重構(gòu)、血管平滑肌細(xì)胞的分化、血管穩(wěn)定性等，血管生成素及其受體、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）／VEEFR、成纖維細(xì)胞生長因子及其受體、血小板源生長因子及其受體等信號通路在腫瘤的血管形成也起重要作用[12-13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，PI3K／AKT和MEK／ERK信號通路參與結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程。抑制兩信號通路后，內(nèi)皮細(xì)胞的水平、垂直和定向遷移均受抑制，且與濃度呈正相關(guān)。細(xì)胞遷移是一涉及多步驟復(fù)雜過程，包括細(xì)胞極化，偽足生成，偽足與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，細(xì)胞體收縮，細(xì)胞尾端和周期基質(zhì)解離，最終向前運(yùn)動。VEGF是影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移的重要因子，Luangdilok等[14]通過對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌研究發(fā)現(xiàn)，抑制兩信號通路能抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。Karar等[15]發(fā)現(xiàn)，突變的ras可以通過激活腫瘤細(xì)胞中的PI3K／AKT增加VEGF的分泌，來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞定向遷移。Chung等[16]發(fā)現(xiàn)，抑制兩信號通路都可以抑制由芝麻素誘導(dǎo)的ERK、AKT、eNOS和p38MAPK磷酸化，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。以上資料均證明，PI3K／AKT和MEK／ERK信號通路參與了細(xì)胞遷移過程，并與本研究的結(jié)果一致，抑制兩信號通路能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

PI3K／AKT和MEK／ERK兩信號通路對細(xì)胞遷移的作用也不完全相同，同等濃度LY294002較PD98059對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響更明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制兩信號通路均能抑制VEGFA的表達(dá)，但抑制MEK／ERK通路能抑制VEGFC的表達(dá)，抑制PI3K／AKT通路，VEGFC的表達(dá)沒有發(fā)生改變[15]。Yoshizuka等[17]發(fā)現(xiàn)，抑制p38可以可以減弱VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，PD98059可以抑制VEGF誘導(dǎo)的p38和ERK1／2的活性，但不影響PRAK。而p38可以激活PRAK誘導(dǎo)內(nèi)細(xì)胞遷移。以上研究顯示，兩信號通路對VEGF的表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響不一樣。缺氧可以刺激腫瘤細(xì)胞增加VEGF分泌，從而激活Ras-PI3K／AKT通路，研究表明活化的PI3K可以通過與膜上的磷脂和相鄰的Ras結(jié)合發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生極化，確定腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方向，PI3K／AKT活化后可以進(jìn)而激活Rac、Rho，調(diào)節(jié)細(xì)胞偽足生成、細(xì)胞收縮等，RhoA和Rac通過Rho-激酶和PAK調(diào)節(jié)細(xì)胞尾部解聚，使細(xì)胞遷移[18]。VEGF也可以激活Ras-Raf-MEK／ERK信號通路，激活的ERK通過肌球蛋白輕鏈激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞突觸和促進(jìn)細(xì)胞局部黏附，另一方面其也可以通過鈣蛋白酶促進(jìn)黏附解聚[19]。說明兩信號通路均參與細(xì)胞定向遷移，但在遷移過程的作用不同。細(xì)胞遷移的速率決定于偽足突出和黏附釋放的速度?？焖僖苿拥募?xì)胞移動的速率決定于偽足突出的速率，而緩慢移動的細(xì)胞移動速度決定于黏附釋放的速度。偽足突出的速率是決定著細(xì)胞移動速度的關(guān)鍵，而PI3K參與細(xì)胞極化和偽足生成。細(xì)胞的化學(xué)趨向性決定著細(xì)胞遷移的方向，本實驗中抑制PI3K／AKT信號通路對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移及垂直遷移的影響比MEK／ERK信號通路明顯，說明在結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移和垂直遷移過程中PI3K／AKT決定著細(xì)胞遷移的速率，這與兩信號通路的在細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制相符。ERK主要通過參與細(xì)胞黏附和解聚，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移速率。在細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗中，也表現(xiàn)為PI3K／AKT信號通路對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移影響比MEK／ERK信號通路明顯，說明兩信號通路對細(xì)胞黏附和解聚的調(diào)節(jié)也有差異。由此本研究推測聯(lián)合應(yīng)用兩抑制劑可能協(xié)同增強(qiáng)抑制效應(yīng)，這種抑制效應(yīng)在細(xì)胞定向遷移和趨化遷移中可能表現(xiàn)更明顯。

綜上所述，腫瘤血管的生成是一涉及到多條信號通路，多步驟復(fù)雜的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K／AKT和MEK／ERK信號通路均能抑制結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的水平、垂直和定向遷移，且與抑制劑濃度呈正相關(guān)；抑制PI3K／AKT信號通路對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響比MEK／ERK信號通路明顯，聯(lián)合應(yīng)用兩抑制劑可能協(xié)同增強(qiáng)抑制作用。對PI3K／AKT和MEK／ERK的表達(dá)及其在內(nèi)皮細(xì)胞不定向遷移、增殖、管道形成中的作用有待進(jìn)一步的研究。

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