索 潔，李建峰，趙 瑾，陶 林，楊曉萍△

（新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1．第一附屬醫(yī)院腎病科；2．病理科，新疆石河子832000）

系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulo nephritis，MsPGN）是中國原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型［1－2］，各種損傷因子引起的系膜細(xì)胞（mesangial cell，MC）增生是多種類型腎小球腎炎的共同病理表現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）的集聚是導(dǎo)致腎小球硬化和促使各種腎小球腎炎向終末期腎?。‥SRD）轉(zhuǎn)化的中心環(huán)節(jié)。有研究表明，1，25（OH）2D3可顯著抑制體外培養(yǎng)的 MC增殖、誘導(dǎo)其分化、促進(jìn)其凋亡［3］，其作用機(jī)制和原理目前尚無定論。本實(shí)通過建立大鼠抗胸腺細(xì)胞抗體（anti－Thymocyte cell－1，Thy1）腎炎［3］，給予不同劑量1，25（OH）2D3干預(yù)，用免疫組化法檢測腎小球內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase－3）的表達(dá)，TUNEL法檢測腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡，以探討1，25（OH）2D3對MsPGN MC凋亡的影響及其可能機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇清潔級SD大鼠120只，體質(zhì)量（185．4±12．7）g，購自新疆地方流行性疾病控制中心。

1．2 方法

1．2．1 建立腎炎模型 將120只大鼠分為空白對照組（A組，n＝30）和實(shí)驗(yàn)組（n＝90）。A組：每只大鼠尾靜脈一次性注射生理鹽水25μL／100g；實(shí)驗(yàn)組每只大鼠尾靜脈一次性注射單克隆抗Thy1 25μL／100g后，隨機(jī)分為腎炎模型組（B組）、低劑量1，25（OH）2D3組（C組）和高劑量1，25（OH）2D3組（D組），每組30只。

1．2．2 1，25（OH）2D3干預(yù) C、D組從注射Thy1后第1天開始分別給予1，25（OH）2D3（羅鈣全）0．25、0．50μg／d，溶于1 mL花生油中灌胃，共21d。A、B組大鼠同時(shí)給予1mL花生油灌胃，各組大鼠分別于注射后第1、3、7、14、21d各處死6只大鼠，留取腎臟標(biāo)本待測。

1．2．3 檢測1，25（OH）2D3對 MsPGN組織損害的影響 腎組織經(jīng)HE和PAS染色后在光鏡下觀察MC和ECM增生情況，并根據(jù)病理損害程度進(jìn)行分級。參照人MsPGN分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

1．2．4 免疫組化技術(shù)檢測腎小球中Caspase－3的表達(dá)Caspase－3陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出血棕黃色顆粒。高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取選5個(gè)腎小球，觀察染色細(xì)胞的面積和強(qiáng)度，計(jì)算其平均值。

1．2．5 TUNEL法測腎組織細(xì)胞凋亡 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取10個(gè)腎小球計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞占腎小球內(nèi)有核細(xì)胞的比例為陽性率，分別計(jì)數(shù)各組腎小球內(nèi)的陽性細(xì)胞。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所以數(shù)據(jù)采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間和組內(nèi)比較采用方差分析，其中兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 1，25（OH）2D3對Thy1腎炎腎小球損害程度及病理損害的影響 A組大鼠腎組織均為正常腎組織，光鏡下未見MC和ECM增生；B組在各時(shí)間點(diǎn)均可見MC增生，其增生程度隨著時(shí)間的延續(xù)呈加重趨勢，并可見毛細(xì)血管袢受壓嚴(yán)重，出現(xiàn)結(jié)節(jié)和團(tuán)塊狀實(shí)性區(qū)，部分腎小球出現(xiàn)分葉、硬化和纖維化，至14d時(shí)MC增生減輕；與B組比較，C、D組大鼠腎組織在各時(shí)間點(diǎn)MC增生程度均顯著減輕（P＜0．05），鏡下可見毛細(xì)血管袢輕度受壓，系膜寬度未超過毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布；C、D組大鼠腎組織在各時(shí)間點(diǎn) MC增生程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1、圖1（只比較 A、B、D組病理PAS染色結(jié)果，圖2、3相同）。

表1 各組不同時(shí)間腎組織病變程度積分值比較（x±s，n＝6）

圖1 不同時(shí)間段、不同組間PAS染色結(jié)果（×400）

表2 不同時(shí)段各組間腎小球內(nèi)Caspase－3的表達(dá)量（x±s，n＝6）

圖2 不同時(shí)段、不同組間Caspase－3的表達(dá)結(jié)果

圖3 不同組間、不同時(shí)段腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞結(jié)果

表3 TUNEL測定不同時(shí)間段各組間腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（x±s，n＝6）

2．2 Caspase－3在各組腎小球中的表達(dá)量比較 Caspase－3為細(xì)胞質(zhì)著色，呈淡黃色或黃色。A組腎小球中無Caspase－3的表達(dá)；B組第1天腎小球細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見Caspase－3的表達(dá)，第3天有所下降，在第7天時(shí)明顯增多，第14天表達(dá)再度減少，第21天持續(xù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與B組比較，C、D組在各時(shí)段均有Caspase－3的表達(dá)，趨勢與B組相同，且表達(dá)量高于B組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；D組表達(dá)較C組更強(qiáng)，C、D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。各組腎小球內(nèi)Caspase－3的表達(dá)量，見表2、圖2。

2．3 1，25（OH）2D3對腎組織細(xì)胞凋亡的影響 A組腎小球內(nèi)有少量凋亡細(xì)胞；B組在不同時(shí)間段內(nèi)均可見陽性凋亡細(xì)胞，隨著時(shí)間延長逐漸增多；與B比較，C、D組在第1天即可見較多的凋亡細(xì)胞，3d達(dá)高峰，7、14d開始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；C組細(xì)胞凋亡數(shù)量3d時(shí)較D組高，余各時(shí)段均較D組低，但C、D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表3、圖3。

3 討 論

作為腎小球內(nèi)的固有細(xì)胞之一，MC異常增殖及其繼發(fā)的炎癥介質(zhì)釋放、ECM的病理性聚集，是導(dǎo)致腎小球硬化，使各種腎小球腎炎向ESRD發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此，采用各種干預(yù)措施維持MC增生、肥大與凋亡之間的平衡及改善系膜基質(zhì)代謝是延緩或逆轉(zhuǎn)腎小球硬化的關(guān)鍵。所以，尋找抑制MC增生、誘導(dǎo)MC凋亡的藥物對于臨床上治療各種腎小球腎炎具有重要意義。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)1，25（OH）2D3除了經(jīng)典的鈣磷代謝調(diào)節(jié)功能外，還具有多種生物功能，如抑制多種腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞的增殖等［4－8］，1，25（OH）2D3對 MC有無作用及是何種作用，本課題組前期的研究已經(jīng)證實(shí)，1，25（OH）2D3能夠有效抑制體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞增殖［9］。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用TUNEL法測定腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，腎炎組腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡隨時(shí)間推移逐漸增多，而使用1，25（OH）2D3干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組在藥物干預(yù)后第1天開始凋亡細(xì)胞就明顯增多，并在第3天到達(dá)高峰，此后逐漸降低，提示1，25（OH）2D3可早期誘導(dǎo)GCM凋亡，對腎臟具有保護(hù)作用。此外，研究結(jié)果還提示，1，25（OH）2D3的作用強(qiáng)度與劑量相關(guān)，高劑量較低劑量作用更為明顯。另外，與B組相比，C、D組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的組織形態(tài)學(xué)改變也明顯減輕；第7天腎臟病理顯示MC以及ECM明顯減少，炎癥因子積聚減輕，球囊粘連偶爾可見等，說明1，25（OH）2D3對于Thy1腎炎的調(diào)控不僅是在抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，而且也體現(xiàn)在組織形態(tài)學(xué)改變方面。

在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)、發(fā)展過程中，有許多基因及其產(chǎn)物的參與，其調(diào)控過程十分復(fù)雜，目前已知的凋亡信號傳導(dǎo)通路有死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，均能激活Caspase－3［10－15］，并可通過水解各種細(xì)胞成分而使細(xì)胞凋亡。在本研究中，對照組中腎小球中無Caspase－3的表達(dá)，B組在Thy1抗體注射后1d即出現(xiàn)Caspase－3的表達(dá)，出現(xiàn)第1個(gè)表達(dá)高峰，這與注射Thy1抗體后1d內(nèi)出現(xiàn)系膜細(xì)胞核固縮、細(xì)胞溶解有關(guān)；第3天時(shí)有所下降；隨著腎炎病程的發(fā)展，增生的系膜細(xì)胞及浸潤的炎細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡途徑而清除，Caspase－3在第7天時(shí)再次升高，出現(xiàn)第2個(gè)表達(dá)高峰；在第14天和第21天的檢測中持續(xù)下降。C、D組總體趨勢與B組相同，但表達(dá)量更高，其中以D組的表達(dá)最強(qiáng)，C組次之，但各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。本實(shí)驗(yàn)通過使用不同劑量1，25（OH）2D3干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Caspase－3的表達(dá)與藥物劑量呈正相關(guān)，提示在本實(shí)驗(yàn)中1，25（OH）2D3參與了對Caspase－3的調(diào)節(jié)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，促進(jìn)Thy1腎炎的轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，本研究證實(shí)了1，25（OH）2D3具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且受藥物劑量影響，高劑量的1，25（OH）2D3在誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡中的作用最強(qiáng)。1，25（OH）2D3參與了腎小球中Caspase－3的調(diào)控，并在Thy1腎炎早期誘導(dǎo)腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了炎癥的修復(fù)，從而早期延緩腎小球疾病的進(jìn)展，保護(hù)腎臟。

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