摘要：以青海高寒地區(qū)分布范圍廣、種植面積大、飼用價(jià)值較高的燕麥為對(duì)象，對(duì)其附著乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)適合青海地區(qū)人工種植燕麥青貯的乳酸菌包括B74（植物乳桿菌）、B101（植物乳桿菌）、GC10（植物乳桿菌）、R2（干酪乳桿菌）、HT4（片球菌）、PP（片球菌）、D1404（糞產(chǎn)球菌或戊糖片球菌）。

關(guān)鍵詞：青海??；高寒地區(qū)；燕麥；青貯乳酸菌；篩選；菌落形態(tài)；菌株類型；青貯試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S816.5+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0205-04

收稿日期：2014-04-09

基金項(xiàng)目：青海省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：2010-N-516）。

作者簡(jiǎn)介：徐婷（1986—），女，湖北孝感人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：xutinghubei@163.com。

通信作者：劉書杰，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：mkylshj@126.com。青海省是我國(guó)五大牧區(qū)之一，牧草的需求量非常大[1]。近年來(lái)，燕麥開始在牧區(qū)大量種植，已成為高寒牧區(qū)枯草季節(jié)的重要飼草來(lái)源。人工種草制作青貯飼料，是解決高寒草地畜牧業(yè)冬春季節(jié)飼草料嚴(yán)重不足的有效措施之一[2]。乳酸菌在飼料工業(yè)中，尤其在青貯飼料的制備領(lǐng)域中有重要的作用[3-7]。青海高寒牧區(qū)的極端氣候環(huán)境使得傳統(tǒng)商品化乳酸菌在該地區(qū)的應(yīng)用受到了限制，很難調(diào)制出品質(zhì)良好的青貯飼料。因此，發(fā)掘和利用高寒地區(qū)鄉(xiāng)土產(chǎn)乳酸菌種質(zhì)資源，對(duì)于在該地區(qū)制作青貯飼料具有重要的實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料青海省貴南草業(yè)有限股份公司種植的青燕3號(hào)燕麥及表層土樣，采集于青海省貴南縣過(guò)馬營(yíng)鎮(zhèn)，海拔約3 300 m；青海海北州高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技試驗(yàn)示范園種植的加拿大燕麥及表層土洋，采集于青海省海晏縣，海拔約 3 200 m。

1.1.2儀器恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、超低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、振動(dòng)器、pH計(jì)、天平、光學(xué)顯微鏡、PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、液相色譜儀，紫外分光光度計(jì)。

1.1.3試劑MRS培養(yǎng)基（參考中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的配方）：酵母粉15 g/L，葡萄糖60 g/L，酪蛋白胨30 g/L，檸檬酸氫二胺6 g/L，乙酸鈉15 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4 0.75 g/L，吐溫-80 3 mL/L，K2HPO4 6.0 g/L，牛肉膏 30 g/L，瓊脂15 g/L。113 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌，每平皿約20 mL。

MC培養(yǎng)基（參考中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的配方）：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，瓊脂15 g/L。121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌，每平皿約20 mL。

鏡檢（采用G+染色）：草酸銨結(jié)晶紫，碘液，番紅。

凝膠電泳：瓊脂糖，TBE緩沖液，StarSpin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，陽(yáng)性對(duì)照菌種為大腸桿菌。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備取自然發(fā)酵的青貯飼料500 g左右密封保存，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2青貯飼料中菌群結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)分為4組：第Ⅰ組編號(hào)GC（貴南燕麥青草樣）、第Ⅱ組編號(hào)GT（貴南燕麥地表層土樣）、第Ⅲ組編號(hào)HY（海晏燕麥青草樣）、第Ⅳ組編號(hào)HT（海晏燕麥地表層土樣）。取乳熟期整株燕麥減碎至1～2 cm，混勻稱重，土捏碎稱取3 g，加10倍的已滅菌的生理鹽水浸泡2 h，使表層含有的菌游離于生理鹽水中，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌室中進(jìn)行。

將浸泡草樣及土樣的液體置于振蕩器上振蕩使菌均勻分布，分別取菌液作梯度稀釋液：10-1～10-5。取稀釋液在MRS培養(yǎng)基（添加制霉菌素50 mg/mL以抑制霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)）平板上涂布，每個(gè)稀釋梯度取200 mL涂布3皿，涂布完成后置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3菌落形態(tài)特征觀察平板計(jì)數(shù)后，根據(jù)公式計(jì)算燕麥附著乳酸菌的活菌數(shù)（CFU/g）：活菌數(shù)=（同一稀釋度的重復(fù)平板上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/含菌樣品質(zhì)量。計(jì)數(shù)后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并描述各菌株的菌落形態(tài)特征。

1.2.4細(xì)菌革蘭氏染色觀察挑取典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，挑取培養(yǎng)48～72 h的菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，100倍油鏡觀察。

革蘭氏染色法：取10 μL水于載玻片中央，再用接種環(huán)挑取少量菌落與載玻片上的水滴均勻混合并涂成薄的菌膜自然干燥，玻片向上在乙醇燈上快速烤干，結(jié)晶紫初染1 min后用水充分淋洗，滴加碘液媒染1～2 min水洗，用水充分淋洗后用吸水紙吸干水分，用95%乙醇脫色20 s并水洗，番紅復(fù)染 1～2 min 水洗，自然干燥100倍油鏡觀察。藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌，紅色為革蘭氏陰性菌。

1.2.5乳酸菌的分離和純化根據(jù)菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等挑取有透明圈的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡鏡檢，凡是疑似為乳酸菌并以劃線的方式在MRS培養(yǎng)基上繼續(xù)分離純化培養(yǎng)2次。如果鏡檢發(fā)現(xiàn)不純，就繼續(xù)劃線純化，直至純化為止。將純化后的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將菌液接種到保存液（含60%甘油，體積為1 ∶1）中，并在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6乳酸菌的初步篩選將鑒定過(guò)的乳酸菌分別按3%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定不同菌株發(fā)酵液pH值，繪制的產(chǎn)酸速率曲線即不同發(fā)酵時(shí)間（h）所對(duì)應(yīng)發(fā)酵液pH值的變化曲線，根據(jù)不同菌株的產(chǎn)酸能力以及產(chǎn)酸速率來(lái)篩選適宜的用作青貯飼料的菌株。用待測(cè)菌株培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液，以3%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以培養(yǎng)基為空白，在620 nm下測(cè)定樣品的吸光度。endprint

1.2.7優(yōu)良乳酸菌的菌種鑒定優(yōu)良乳酸菌的菌種鑒定采用16S rRNA序列測(cè)定，即分離的乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后進(jìn)一步純化并進(jìn)行菌株DNA的提取，DNA提取試劑盒由天根生化試劑（北京）有限公司提供，DNA提取及純化按照試劑盒使用方法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1分離菌株菌落形態(tài)及菌體細(xì)胞形態(tài)觀察

由表1可以看出，所篩菌種大多為中等大小、中間凸起、表面光滑的白色菌落。

2.2乳酸菌的初步篩選

從pH值下降快、生長(zhǎng)速度快指標(biāo)進(jìn)行篩選，初篩出菌號(hào)為R2、R6、HC58、HC64、HT4、 HT2、GC10、GC21、 GC26、 GC44、B29、 B74、 B90、 B101的菌（表2）。

2.3細(xì)菌革蘭氏染色觀察

圖1顯示，所選菌大多為桿菌，1個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)。

2.4優(yōu)良乳酸菌的篩選

將pH值下降快、生長(zhǎng)速度快的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模模擬青貯試驗(yàn)，其pH值測(cè)定結(jié)果見表3，其中編號(hào)為R2、HT4、GC10、GC44、B101、D1404、YX的pH值下降快且穩(wěn)定，可用于袋貯青貯試驗(yàn)。

2.5青貯菌種鑒定結(jié)果

篩選出的優(yōu)勢(shì)菌種經(jīng)測(cè)序后冷凍干燥制成菌劑，并測(cè)定其活菌數(shù)，篩選出的菌種情況見表4。

3結(jié)論與展望

以青海高寒地區(qū)分布范圍廣、種植面積大、飼用價(jià)值較高的燕麥為原料，對(duì)其附著乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)適合青海地區(qū)人工種燕麥青貯的乳酸菌包括B74（植物乳桿菌）、B101（植物乳桿菌）、GC10（植物乳桿菌）、R2（干酪乳桿菌）、HT4（片球菌）、PP（片球菌）、D1404（糞產(chǎn)球菌或戊糖片球菌）。

畜牧業(yè)是青海的支柱產(chǎn)業(yè)，但是目前青海草場(chǎng)退化、草畜不平衡、自然災(zāi)害頻發(fā)，一直制約著青海畜牧業(yè)發(fā)展，而青貯飼料是解決青海牧區(qū)飼草不平衡的有效措施之一。目前，我國(guó)對(duì)青貯飼料的調(diào)制主要利用國(guó)外商業(yè)化的乳酸菌制劑，但是在青海高寒地區(qū)燕麥?zhǔn)斋@季節(jié)的氣溫大概在15 ℃左右，低菌株編號(hào)菌株類型活菌數(shù)（CFU/g）B74植物乳桿菌4.31×1011B101植物乳桿菌1.49×108GC10植物乳桿菌6.40×1010R2干酪乳桿菌6.41×1011HT4片球菌3.73×1011PP片球菌1.07×1011D1404糞產(chǎn)球菌或戊糖片球菌1.00×108YX商品混合菌（臺(tái)灣亞芯）1.00×108

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