加吾拉·阿不力孜 王鑫 李芙 白楊 姚海江 莫雨平 周源 許紅 毛穎秋 高譽珊 張偉 張忠 李志剛 薛衛(wèi)國

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觀察電針“百會”、“涌泉”兩穴對不同月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ淀粉樣沉淀及超微結(jié)構(gòu)的影響

加吾拉·阿不力孜 王鑫 李芙 白楊 姚海江 莫雨平 周源 許紅 毛穎秋 高譽珊 張偉 張忠 李志剛 薛衛(wèi)國

目的 觀察電針“百會”、“涌泉”兩穴對5月齡和10月齡淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1(amyloid precursor protein/presenilin-1, APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因鼠海馬β淀粉樣蛋白(Amyloid β Protein, Aβ)沉積及超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 分別將4月齡和9月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠按隨機分配法分為模型組、電針組和藥物組，以相同月齡同窩陰性小鼠作為對照組，4月齡每組12只，9月齡每組11只。電針組取“百會”、“涌泉”兩穴，每次留針時間為15分鐘，隔日1次，治療5周；藥物組予多奈哌嗪片0.92 mL/g灌胃，取腦透射電鏡片并觀察。結(jié)果 5月齡透射電鏡結(jié)果顯示：在微血管、神經(jīng)元突觸及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)上對照組優(yōu)于模型組。10月齡透射電鏡結(jié)果顯示：模型組海馬出現(xiàn)Aβ淀粉樣沉淀——老年斑。結(jié)論 5月齡小鼠行為學(xué)出現(xiàn)阿爾茨海默病樣改變；10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬出現(xiàn)老年斑；電針治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可能對海馬超微結(jié)構(gòu)有保護作用。

阿爾茨海默癥； 淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1； 海馬； 超微結(jié)構(gòu)； 電針

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)多發(fā)于老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失為主要病理改變的進行性神經(jīng)變性疾病。β淀粉樣蛋白(Amyloid β Protein, Aβ)被認(rèn)為是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要原因[1]。淀粉樣肽瀑流學(xué)說：此項學(xué)說強調(diào)Aβ聚集在導(dǎo)致老年斑形成、突觸減少、神經(jīng)功能失調(diào)、神經(jīng)元死亡以及有臨床癥狀的癡呆上起到關(guān)鍵作用，聚集可形成神經(jīng)毒素的原纖維，并進而組成阿爾茨海默病的病理特征之一老年斑[2]。Aβ為生理條件下的正常代謝產(chǎn)物，不斷產(chǎn)生又迅速被清除，但當(dāng)發(fā)生遺傳或環(huán)境因素變化導(dǎo)致如淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)和早老蛋白1(presenilin-1, PS1)或者PS2基因突變，導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生增加沉積形成老年斑，即可誘發(fā)AD。課題組以有毒Aβ1-42在海馬的表達(dá)為切入點，研究電針對有毒Aβ1-42在海馬沉積的影響，探討電針對腦海馬宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性4月齡和9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分別為36只和33只，隨機分為模型組、藥物組和電針組，4月齡每組12只，9月齡每組11只。相同月齡同窩陰性小鼠分別12、11只作為對照組。實驗動物皆購自南京大學(xué)模式動物研究所，許可證編號：SYXK(蘇)2010-003，4月齡體重(31.8±3.5)g；10月齡體重(42.7±5.5)g。普通小鼠飼料單籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃。實驗過程中兩組電針組各死亡一只小鼠。

1.2 主要試劑與儀器

Hans-100A型韓式電針儀(南京濟生醫(yī)療有限公司)，華佗牌無菌針灸針(0.18 mm×13 mm)，Olympus BX5顯微鏡，日本尼康NIS-Elements圖像分析系統(tǒng)；JEM1230型透射電鏡(日本電子公司)。Abcam Aβ抗體(ab10148)，超敏試劑盒(兔)，DAB顯色試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液，戊二醛溶液，鵝酸，丙酮溶液，SPI樹脂套裝，硝酸鉛，檸檬酸鈉，醋酸雙氧鈾等。

1.3 針刺方法

電針組將小鼠以自制鼠袋固定，按照小鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學(xué)方法，取“百會”、“涌泉”兩穴。穴位與針具常規(guī)消毒后，刺入2～3 mm。在兩“涌泉”穴接HANs-100電針儀，采用疏密波，頻率為2/100 Hz，強度1 mA，以小鼠足趾收縮但不掙扎嘶叫為度。針刺時間為15分鐘，隔日1次，治療5周。對照組、模型組予相同規(guī)格鼠套束縛15分鐘，隔天1次，束縛5周，不予其他治療，藥物組予多奈哌嗪0.92 mL/g灌胃，鼠套束縛同對照組。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

(1) 取材：兩組不同月齡的實驗動物經(jīng)5周治療至分別滿5月齡和10月齡左右后取材。以10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉。透射電鏡片：心臟灌注同上，取腦放入2.5%的戊二醛溶液固定2小時以上，4℃進行固定。(2) 磷酸緩沖液pH：7.2沖洗3次，每次10分鐘。(3) 1%鵝酸室溫固定2小時。(4) 雙蒸水沖洗3次，每次10分鐘。(5) 梯度丙酮脫水：50%—70%—80%—90%—100%，3次，各10分鐘。(6) 滲透：812環(huán)氧樹脂與100%丙酮1∶3滲透30分鐘；環(huán)氧樹脂與100%丙酮1∶1滲透30分鐘；環(huán)氧樹脂與100%丙酮3∶1滲透30分鐘；純812樹脂滲透120分鐘。(7) 純樹脂包埋(Epon812)聚合37℃ 16小時；45℃ 24小時；60℃ 48小時。(8) 修塊。(9) 半博切片；甲苯胺藍(lán)染色2分鐘，洗凈，光鏡下定位觀察。(10) 2%醋酸雙氧鈾染色25分鐘后，立即沖洗，待銅網(wǎng)干燥無水后，2%檸檬酸鉛染色5～7分鐘及使用新鮮制備的蒸餾水沖洗干凈。(11) 電鏡觀察：JEM-1230型透射電鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 電針對不同月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠海馬微血管超微結(jié)構(gòu)的影響

5月齡小鼠海馬微血管(放大50000倍)：模型組血管基膜增厚，邊界模糊結(jié)構(gòu)不清，基膜外出現(xiàn)小量不規(guī)則絮狀條形物，周圍組織排列疏松；電針組血管基膜結(jié)構(gòu)較模型組完整層次清，血管周圍結(jié)構(gòu)清晰，但排列不緊密，線粒體結(jié)構(gòu)清晰；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹溶解，血管壁結(jié)構(gòu)層次不清，周圍組織排列疏松；對照組血管基膜完整，結(jié)構(gòu)層次清晰，周圍組織排列疏松。見圖1。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：黃色箭頭為血管壁；綠色箭頭為線粒體圖1 5月齡APP/PS1小鼠海馬微血管超微結(jié)構(gòu)(×50000)

10月齡小鼠海馬微血管(放大20000倍)：模型組血管基膜邊界不清或溶解，基膜外出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀條形物，血管壁內(nèi)容物萎縮，血管內(nèi)壁輪廓不清或有贅生物，血管壁線粒體結(jié)構(gòu)不清或溶解，血管周圍組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞排列疏松且結(jié)構(gòu)不清，有次級溶酶體出現(xiàn)；電針組血管基膜完整，內(nèi)容物出現(xiàn)腫脹但結(jié)構(gòu)清晰，血管壁線粒體結(jié)構(gòu)清晰，可見部分線粒體嵴斷裂或溶解，血管內(nèi)壁出現(xiàn)少許贅生物結(jié)構(gòu)不清，血管周圍局部出現(xiàn)次級溶酶體且部分溶解出現(xiàn)脂滴，周圍細(xì)胞出現(xiàn)溶解；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹結(jié)構(gòu)不清清，血管壁線粒體嵴斷裂多呈空泡狀，血管壁周圍出現(xiàn)溶酶體并有溶解形成脂滴，周圍還出現(xiàn)不規(guī)則絮狀條形物；對照組血管基膜完整，線粒體結(jié)構(gòu)層次清晰，血管周圍神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞排列緊密有序。見圖2。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：黃色箭頭為血管壁；紅色箭頭為不規(guī)則絮狀條形物；綠色箭頭為線粒體；藍(lán)色箭頭為溶酶體；紫色箭頭為溶酶體中脂滴圖2 10月齡APP/PS1小鼠海馬微血管超微結(jié)構(gòu)(×20000)

2.2 電針對不同月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠海馬神經(jīng)氈超微結(jié)構(gòu)的影響

5月齡海馬神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)(放大50000倍)：模型組神經(jīng)突觸的部分突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)模糊不清或增寬，突觸小泡有所減少，突觸后致密物厚度減少或消失；電針組前后膜較清晰，間隙不明顯，突觸小泡較模型組有所增多，突觸后致密物厚度有所減小；藥物組前后膜較清晰，間隙明顯且間距小，突觸小泡減少，突觸后致密物變薄。對照組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，其突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)清晰，突觸前終末有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚度大。見圖3。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：藍(lán)色箭頭為線粒體；黃色箭頭為突觸后致密物質(zhì)圖3 5月齡APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)氈超微結(jié)構(gòu)(×50000)

10月齡海馬神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)(放大50000倍)：模型組出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，細(xì)胞內(nèi)容物結(jié)構(gòu)溶解紊亂不清，突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)模糊不清；電針組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，其突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)較清晰，突觸前膜有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚適中，細(xì)胞排列疏松不規(guī)則。藥物組神經(jīng)氈出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，部分細(xì)胞內(nèi)容物溶解結(jié)構(gòu)不清，線粒體嵴斷裂，部分呈空泡狀，突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸前膜突觸小泡減少，突觸后致密物厚度消失；對照組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，其突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)清晰，突觸前膜有較多的突觸小泡，突觸后膜致密物厚度大，線粒體結(jié)構(gòu)完整。見圖4。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組 注：紅色箭頭為老年斑；藍(lán)色箭頭為線粒體；黃色箭頭為突觸后致密物質(zhì)圖4 10月齡APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)氈超微結(jié)構(gòu)(×50000)

2.3 電針對10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬老年斑沉積的影響

10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型組血管(放大5000倍)周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀結(jié)構(gòu)，周圍有少量次級溶酶體，神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)不清；電針組血管基膜增厚，血管壁內(nèi)容物增厚，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體呈空泡狀，周圍細(xì)胞出現(xiàn)次級溶酶體，神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)層次清晰；藥物組血管基膜略有增厚，周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀結(jié)構(gòu)，周圍出現(xiàn)暗黑色顆粒，神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)不清；對照組血管基膜完整，血管周圍神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)層次清晰，線粒體結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，結(jié)構(gòu)清晰。見圖5。

A 模型組；B 電針組；C 藥物組；D 對照組注：紅色箭頭為老年斑；白色箭頭為次級溶酶體圖5 10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)(×5000)

3 討論

3.1 電針治療對不同月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬微血管超微結(jié)構(gòu)的影響

腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積主要是由有毒Aβ聚集形成的，本實驗從5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠透射電鏡片結(jié)果得出模型組小鼠在腦海馬微血管基膜增厚，血管壁內(nèi)容物腫脹、輪廓不清等不同程度的改變，這些表現(xiàn)可能是由于受體在轉(zhuǎn)運Aβ的過程中，有毒Aβ?lián)p傷了微血管壁的結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)運受體不能正常的將Aβ從腦內(nèi)轉(zhuǎn)運至腦外，使Aβ經(jīng)血腦屏障的向外轉(zhuǎn)運減少，導(dǎo)致有毒Aβ在腦內(nèi)濃度升高；血管基膜外的不規(guī)則絮狀物可能是有毒Aβ血管周圍沉積的表現(xiàn)，可能是老年斑形成的初始時期。10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬透射電鏡片可以看出：模型組血管基膜不規(guī)則增厚，血管內(nèi)壁輪廓不清，血管周圍神經(jīng)氈出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀組織，這可能是Aβ的毒性在轉(zhuǎn)運過程中損傷了微血管壁結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致Aβ經(jīng)血腦屏障向外轉(zhuǎn)運受阻，血管周圍出現(xiàn)大片不規(guī)則絮狀物沉積——老年斑。

5月齡組電針組血管基膜結(jié)構(gòu)較模型組完整層次清，血管周圍結(jié)構(gòu)清晰，提示電針可能有保護腦海馬微血管結(jié)及功能的作用；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹溶解，血管壁結(jié)構(gòu)層次不清，可能是因為Aβ的毒性損傷到了腦海馬微血管結(jié)構(gòu)，影響到了血管功能，藥物沒有對腦組織結(jié)構(gòu)起到保護作用；10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠電針組可能是因為Aβ的毒性損傷到了血管結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致血管內(nèi)容物腫脹變形，血管周圍局部出現(xiàn)次級溶酶體且部分溶解出現(xiàn)脂滴，可能是因為電針激活了神經(jīng)自噬系統(tǒng)[3]，出現(xiàn)大量溶酶體吞噬了有毒Aβ形成脂滴，可能提高了血管自我保護能力；藥物組血管壁內(nèi)容物腫脹結(jié)構(gòu)不清，血管壁線粒體嵴斷裂多呈空泡狀，可能是因為Aβ的毒性損傷到了血管結(jié)構(gòu)及功能，周圍還出現(xiàn)不規(guī)則絮狀條形物,可能是老年斑前體，提示藥物對海馬超微結(jié)構(gòu)無明顯保護作用；對照組血管基膜完整，結(jié)構(gòu)層次清晰，這表明APP/PS1同窩陰性鼠是良好的對照模型。

3.2 電針治療對不同月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)的影響

電針對AD治療效應(yīng)的發(fā)揮可能與減輕線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，改善線粒體功能，進而改善能量代謝和腦功能有關(guān)。線粒體是細(xì)胞的能量加工廠，通過氧化磷酸化過程為細(xì)胞生命活動提供能量[4]。電針對AD治療效應(yīng)的發(fā)揮可能與減輕線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷、降低Caspase-3、Caspase-9表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡線粒體途徑的級聯(lián)反應(yīng), 減少細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。電針能有效調(diào)整海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進突觸形態(tài)可塑性的發(fā)揮[6]。5月齡小鼠實驗透射電鏡結(jié)果模型組突觸前后膜及間隙不清、突觸小泡減少、突觸后膜致密物厚度減?。浑娽樈M前后膜較清晰，間隙不明顯，突觸小泡較模型組有所增多，這可能是電針治療可以提高腦內(nèi)乙酰膽堿的活性，可能提高了突觸間信號傳遞，減緩腦癡呆樣變的進程，對海馬突觸結(jié)構(gòu)有保護和修復(fù)的作用；藥物組前后膜較間隙明顯減小，突觸小泡有所減少，突觸后致密物變薄，提示藥物沒有對突觸超微結(jié)構(gòu)保護作用；10月齡鼠模型組血管基膜結(jié)構(gòu)功能受損，導(dǎo)致神經(jīng)氈出現(xiàn)大片脂褐色顆粒，破壞了線粒體結(jié)構(gòu)及功能，影響了線粒體—突觸能量傳遞，使得突觸結(jié)構(gòu)及功能收到破壞；電針組神經(jīng)氈有較多神經(jīng)突觸，結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于模型組，可能是因為電針治療對突觸結(jié)構(gòu)起到了保護作用。藥物組神經(jīng)氈出現(xiàn)不規(guī)則致密絮狀物，可能是老年斑的前體，部分細(xì)胞內(nèi)容物溶解結(jié)構(gòu)不清，線粒體嵴斷裂，部分呈空泡狀，突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸小泡減少，突觸后致密物厚度消失，提示藥物對海馬突觸結(jié)構(gòu)無保護作用；對照組神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)優(yōu)于較模型組，提示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠是良好的陰性模型。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠模型是近來公認(rèn)度較高的阿爾茨海默病模型[7]，其行為學(xué)改變和腦病理表現(xiàn)與阿爾茨海默病患者相似度高，本實驗以觀察不同月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)有毒Aβ1-42沉積隨月齡變化，以出現(xiàn)β淀粉樣蛋白沉積為主線，研究阿爾茨海默病發(fā)展及電針對其超微結(jié)構(gòu)的影響。5月齡APP/PS1小鼠腦海馬未見老年斑形成；10月齡APP/PS1小鼠腦海馬區(qū)可見大片老年斑；不同月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠電針組海馬超微結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于模型組和藥物組，表明電針可以延緩或阻斷5月齡和10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦超微結(jié)構(gòu)的AD樣改變進程，延緩了Aβ淀粉樣蛋白沉積發(fā)展成老年斑的這一過程，起到保護腦海馬超微結(jié)構(gòu)的作用。

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(本文編輯：黃凡)

Effect of electro-acupuncture intervention on hippocampus Aβ stain and ultrastructure in APP/PS1 double transgenic rats

Jiawula·Abulizi,WANGXin,LIFu,etal.

SchoolofAcupunture-moxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

LIZhi-gang,E-mail:lizhigang620@126.com;XUEWei-guo,E-mail:snowmanxue@163.com

Objective To observe the influence of electro-acupuncture(EA) at “Baihui”(GV20) and “Yongquan”(KI1) on hippocampal Aβ stain and ultrastructure in 5-month-old and 9-month-old APP/PS1 double transgenic rat. Methods 4-moth-old and 9-month-old APP/PS1 double transgenic rats were according to the random assignment method divided into model group, EA group and drug(AChE) group and drug group with 12 rats each in 4-month-old groups and 11 rats each in 9-month-old groups, and the same months old rats with brood recessive gene were set as control group. Treatment was applied to “Baihui”(GV20) and “Yongquan”(KI1) for 15 mins, once every 2 days for 5weeks; For the drug group,0.92 mL/g of acetylcholine enzyme was given by gavage, once a day. Rat brains were taken to make transmission electric lens for observation. Results On transmission electron microscopy (sem) results showed that in 5-month-old rats, the capillaries, synapses and ultrastructure of neurons in the control group were better than the model group. In 10-month-old rats, there was senile plaque in the model group. Conclusion Alzheimer's disease-like behavior appeared in 5-month-old rats. Senile plague in hippocampus appeared in 10-month-old APP/PS1 double transgenic rats. EA therapy might improve the hippocampus microstructure in APP/PS1 double transgenic rats.

Alzheimer’s disease; Amyloid precursor protein/presenilin-1; Hippocampus; Ultrastructure; Electro-acupuncture

國家自然科學(xué)基金(81273826)

100029北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[加吾拉·阿不力孜(博士研究生)、王鑫(博士研究生)、李芙(碩士研究生)、白楊(碩士研究生)、姚海江(博士研究生)、莫雨平(博士研究生)、周源(碩士研究生)、李志剛、薛衛(wèi)國]，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(許紅、高譽珊、張忠)，科研實驗中心(毛穎秋、張偉)

加吾拉·阿不力孜(1986- )，2012級在讀博士研究生。研究方向：針刺手法及針刺干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail: jack47656@hotmail.com

李志剛(1965- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：針刺手法及針刺干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail: lizhigang620@126.com；薛衛(wèi)國(1968- )，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：針刺治療阿爾茨海默病的機制研究。E-mail: snowmanxue@163.com。李志剛和薛衛(wèi)國并列為本文通訊作者。

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.002

2014-12-08)