牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊 鳳，閆喜武

大連海洋大學(xué)，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 大連 116023

菲律賓蛤仔EST_SSR標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊 鳳，閆喜武*

大連海洋大學(xué)，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 大連 116023

研究利用20 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)菲律賓蛤仔斑馬蛤F2代家系107 個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)與生長(zhǎng)相關(guān)性狀進(jìn)行分析。在20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到41 個(gè)等位基因，各位點(diǎn)等位基因數(shù)為2—3 個(gè)，等位基因片段大小為109—430 bp，平均等位基因數(shù)為2.05 個(gè)。平均有效等位基因數(shù)為1.71個(gè)，觀測(cè)雜合度平均值為0.504，期望雜合度的平均值為0.431，平均多態(tài)信息含量為0.324。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3 個(gè)位點(diǎn)SSR11，SSR164和SSR213的基因型分布顯著偏離了孟德爾定律(P<0.01)。運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與菲律賓蛤仔斑馬蛤家系生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性(殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重)進(jìn)行連鎖顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，SSR9位點(diǎn)與殼高存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，SSR135和SSR164位點(diǎn)與殼寬呈顯著相關(guān)(P<0.05)，SSR142位點(diǎn)與體重呈顯著性相關(guān)(P<0.05)。研究結(jié)果可為菲律賓蛤仔的分子標(biāo)記輔助選育提供參考。

菲律賓蛤仔; 微衛(wèi)星標(biāo)記; 生長(zhǎng)性狀; 相關(guān)分析

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，簾蛤科(Veneridae)，蛤仔屬(Ruditapes)，是我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類之一，廣泛分布在我國南北沿海。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年菲律賓蛤仔世界產(chǎn)量達(dá)到360多萬t[1]，我國年產(chǎn)量在300 萬t左右，占世界菲律賓蛤仔產(chǎn)量的90%以上[2]。由于其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，近年來市場(chǎng)需求量也日益增大。然而由于人工苗種的累代養(yǎng)殖，菲律賓蛤仔養(yǎng)殖群體的種質(zhì)逐漸下降，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迫切需要菲律賓蛤仔的優(yōu)良品種。近年來，菲律賓蛤仔的遺傳改良技術(shù)取得了一定的成績(jī)，如選擇育種和雜交育種等[2-6]。傳統(tǒng)育種方法對(duì)目標(biāo)性狀缺乏準(zhǔn)確可靠的早期預(yù)選手段，造成育種盲目性大、效率低。而緊密連鎖的DNA標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)性狀的早期選擇提供了有效途徑。因此，研究與水產(chǎn)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是對(duì)缺乏遺傳連鎖圖譜的水產(chǎn)動(dòng)物DNA標(biāo)記，就顯得十分重要。

微衛(wèi)星(microsatellites)又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat, SSR)，一般由1—6 bp的簡(jiǎn)單序列重復(fù)排列組成。由于微衛(wèi)星具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、遵循孟德爾分離定律、易于(Polymerase Chain Reaction) PCR擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，是分子遺傳學(xué)研究的理想分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記篩選、(Quantitative Trait Locus) QTL定位等方面[7-15]。在海洋貝類，蝦夷扇貝[16]和馬氏珠母貝[17]等已報(bào)道了生長(zhǎng)性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性分析。目前，對(duì)菲律賓蛤仔的研究，主要集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和養(yǎng)殖技術(shù)等方面[2]。然而，有關(guān)菲律賓蛤仔重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子基礎(chǔ)研究還剛剛起步，標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析迄今還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用20 對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)菲律賓蛤仔斑馬蛤家系進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性進(jìn)行分析，篩選出對(duì)斑馬蛤生長(zhǎng)有利的基因型，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記和生長(zhǎng)性狀的連鎖分析。為菲律賓蛤仔優(yōu)良品系的進(jìn)一步選育，以及遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用斑馬蛤材料為2011年大連石河菲律賓蛤仔野生群體中挑選的斑馬蛤?yàn)橛H本，交配產(chǎn)生F1代群體，上選F1代群體中大的個(gè)體，采用巢式設(shè)計(jì)建立了30 個(gè)F1家系，本實(shí)驗(yàn)所用家系為第8 組家系，隨機(jī)選取其中107 個(gè)個(gè)體，對(duì)所有個(gè)體的殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重進(jìn)行測(cè)量。取部分足尖組織，固定于95%乙醇中用于DNA的提取。

1.2 DNA提取及微衛(wèi)星分析

DNA的提取采用苯酚-氯仿-異戊醇法抽提DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為10 μL，其中DNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各0.4 μL、easytaq MIX 5 μL、ddH2O 3.2 μL。實(shí)驗(yàn)中所用微衛(wèi)星引物的核心序列及退火溫度見表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，退火溫度40 s，72 ℃ 40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色。凝膠在掃描儀上成像，拍照保存后對(duì)電泳譜帶進(jìn)行分析。等位基因大小用100 bp marker為參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)電泳條帶進(jìn)行判讀。

表1 菲律賓蛤仔20個(gè)微衛(wèi)星引物序列和退火溫度Table 1 Characteristics of the 20 polymorphic microsatellite loci from Ruditapes philippinarum

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用PopGene3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、遺傳多樣性分析, 計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)及期望雜合度(He)。根據(jù)Botstein等[18]的方法可計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)。利用PIC-CALC計(jì)算軟件，根據(jù)等位基因頻率來計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量，其計(jì)算公式如下：

式中，n為某一位點(diǎn)上的等位基因數(shù)；pi、pj分別為群體中第i和第j個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率，j=i+1。

用SPSS20.0軟件中的一般線性模型(GLM) 對(duì)菲律賓蛤仔斑馬蛤家系的生長(zhǎng)相關(guān)性狀與20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記相關(guān)性進(jìn)行分析。其線性模型如下：

yij=μ+gi+εij

式中,yij為斑馬蛤某性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體表型值,μ為群體平均值，gi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值，εij為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果

2.1 性狀的表型值分布

經(jīng)測(cè)量得到的殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重4 個(gè)生長(zhǎng)性狀，均符合正態(tài)分布，可直接進(jìn)行相關(guān)性分析。正態(tài)分布信息見表2。

表2 殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重的表型數(shù)據(jù)及正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)Table 2 The phenotypic data of shell lenth, width, height, body weight and normal distribution test

2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)基因型

圖1 引物SSR372和SSR373在斑馬蛤F2 家系部分個(gè)體的聚丙烯電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR product of partial individuals in the F2 family of Ruditapes philippinarum amplified with microsatellite marker SSR372 and SSR373

利用父母本和8個(gè)子代進(jìn)行引物篩選，經(jīng)PCR 擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，從32 對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選得到20 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定，具有多態(tài)性的位點(diǎn)。檢測(cè)了父母本和107 個(gè)F2子代個(gè)體在20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型(表3)。SSR372和SSR373位點(diǎn)在菲律賓蛤仔斑馬蛤家系部分個(gè)體中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到41 個(gè)等位基因，片段大小為109—430 bp，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)2—3 個(gè)，平均等位基因數(shù)2.05 個(gè)，平均有效等位基因數(shù)為1.71 個(gè)。各位點(diǎn)的期望雜合度、觀測(cè)雜合度、基因型分布和多態(tài)信息含量等值見表3。20 個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度平均值為0.431，觀測(cè)雜合度平均值為0.504，多態(tài)信息含量平均值為0.324。在20 個(gè)位點(diǎn)中，有2 個(gè)位點(diǎn)SSR213和SSR261的觀測(cè)雜合度低于期望雜合度，表現(xiàn)出純合子過剩、雜合子不足現(xiàn)象。另外18 個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度則高于期望雜合度，其中SSR11和SSR164的觀測(cè)雜合度與期望雜合度的差異較大。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，有17 個(gè)位點(diǎn)的基因型比例符合孟德爾分離定律，另外3 個(gè)位點(diǎn)SSR11，SSR164和SSR213的基因型分布顯著偏離了孟德爾定律(P<0.01)(表3)。

表3 菲律賓蛤仔20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在斑馬蛤F2家系中的統(tǒng)計(jì)信息Table 3 Statistic information for 20 microsatellite loci in an F2 family of Ruditapes philippinarum

Na: The number of alleles;Ne: Number of effective alleles;Ho: Observed heterozygosity;He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphism information content;P為基因型分離比的卡方檢驗(yàn)；加粗P值代表偏分離的基因型分離比 (P<0.01)

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(General Linear Model, GLM)，對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因型與斑馬蛤主要生長(zhǎng)性狀(殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，經(jīng)方差分析檢驗(yàn)呈顯著性差異的位點(diǎn)。在20 對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，共找出4 個(gè)與斑馬蛤生長(zhǎng)相關(guān)的位點(diǎn)(表4)。SSR9位點(diǎn)與殼高呈顯著關(guān)聯(lián)，SSR135和SSR164與殼寬顯著相關(guān)，SSR142位點(diǎn)與體重呈顯著性相關(guān)。由于相關(guān)分析得到的微衛(wèi)星位點(diǎn)除SSR9號(hào)引物外其他3 個(gè)位點(diǎn)基因型個(gè)數(shù)都小于3，故使用SPSS中compare means過程進(jìn)行不同位點(diǎn)表型值的比較。在SSR9位點(diǎn)上，AA基因型的殼長(zhǎng)，殼寬，殼高和體重4 項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)平均值均高于其他基因型個(gè)體，說明AA基因型對(duì)斑馬蛤生長(zhǎng)起正效應(yīng)。另外，SSR135位點(diǎn)上的BB基因型、SSR142位點(diǎn)上的AA基因型和SSR164位點(diǎn)上的AB基因型，在4 項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)中的平均值均高于各自位點(diǎn)中的其他基因型，說明4個(gè)基因型在各自位點(diǎn)上對(duì)斑馬蛤的生長(zhǎng)具有正效應(yīng)。

表4 20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型主要生長(zhǎng)性狀的平均值及多重比較Table 4 Means and multiple comparisons of major growth traits with different genotypes at 20 microsatellites

上標(biāo)字母表示在同一位點(diǎn)中不同基因型之間差異顯著(P<0.05)，無字母表示基因型間差異不顯著，*表示與生長(zhǎng)相關(guān)的位點(diǎn)

3 討論

群體的遺傳多樣性主要表現(xiàn)在雜合度、等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量三個(gè)方面。雜合度大小可以反映出遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，雜合度期望越高，群體的遺傳結(jié)構(gòu)越復(fù)雜[19]。本實(shí)驗(yàn)中，觀測(cè)雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.504和0.431，說明實(shí)驗(yàn)家系的遺傳變異和遺傳多樣性較豐富。從等位基因來看，有效等位基因越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)值，說明等位基因在群體中的分布越均勻[20]。本研究在20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到41 個(gè)等位基因，其中有效等位基因數(shù)為34 個(gè)，接近于實(shí)際等位基因數(shù)，表明所檢測(cè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因在群體中分布較均勻。多態(tài)信息含量可作為一個(gè)衡量遺傳標(biāo)記所包含的或能提供的遺傳信息容量的指標(biāo)。一般認(rèn)為，在某一群體中，當(dāng)PIC> 0.5時(shí)該位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)，0.25

在許多海洋貝類中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)偏分離的等位基因，這似乎是海洋貝類中普遍存在的現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型分離比顯著偏離孟德爾遺傳定律(P<0.01)，部分位點(diǎn)偏分離的原因可能與生活環(huán)境和人工選擇有關(guān)，再有可能是由隱性致死基因、取樣或基因型判讀錯(cuò)誤等因素引起[22]。大部分微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度與觀測(cè)雜合度基本接近，說明群體內(nèi)的基因型頻率未發(fā)生大的改變。但有2 個(gè)位點(diǎn)SSR11和SSR164的觀測(cè)雜合度明顯大于期望雜合度，在SSR164發(fā)現(xiàn)了一種純合子完全缺失的現(xiàn)象(基因型AA為0)，說明該位點(diǎn)附近可能存在著與之緊密連鎖的隱性致死基因[23]。

菲律賓蛤仔的殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重等性狀屬于數(shù)量性狀，數(shù)量性狀受多個(gè)基因的控制，其遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜且容易受環(huán)境的影響。標(biāo)記與性狀之間的連鎖分析，是根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)的基因型以及數(shù)量性狀的表型對(duì)個(gè)體進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著則說明標(biāo)記與數(shù)量性狀存在關(guān)聯(lián)[24]。因此，如果一個(gè)群體的性狀差異顯著，或兩個(gè)群體的差異很大，就可以通過標(biāo)記與性狀的相關(guān)分析，找出性狀與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的遺傳相關(guān)，一旦發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)，即可認(rèn)為存在一個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)從表型到基因型選擇育種的轉(zhuǎn)變[25]。借助微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行性狀連鎖分析或 QTL 定位，在水產(chǎn)動(dòng)物育種中已也有較多報(bào)道[10-17]。

目前，菲律賓蛤仔遺傳標(biāo)記的開發(fā)較少, 不足以滿足遺傳作圖和QTL 定位的需要。所以，有必要應(yīng)用有限的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)菲律賓蛤仔生長(zhǎng)相關(guān)性狀進(jìn)行連鎖分析。在本研究中，共找到了4 個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，SSR9位點(diǎn)與殼高存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，SSR135和SSR164與殼寬顯著相關(guān)(P<0.05)，SSR142與體重顯著相關(guān)(P<0.05)。在這些關(guān)聯(lián)中，出現(xiàn)了幾個(gè)標(biāo)記同一個(gè)性狀相關(guān)，說明這些位點(diǎn)存在多因一效的現(xiàn)象，并符合數(shù)量性狀的相關(guān)理論。對(duì)上述位點(diǎn)不同基因型的多重比較表明，SSR9位點(diǎn)的AA基因型、SSR135位點(diǎn)的BB基因型、SSR142位點(diǎn)的AA基因型和SSR164位點(diǎn)的AB基因型都與殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重性狀呈正相關(guān)。目前，分子標(biāo)記在菲律賓蛤仔中的應(yīng)用主要集中于遺傳多樣性研究[26-27]，有關(guān)菲律賓蛤仔性狀相關(guān)分子標(biāo)記的篩選迄今未見報(bào)道。本文篩選出菲律賓蛤仔生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，為菲律賓蛤仔分子標(biāo)記輔助選育提供參考。

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Identification of EST_SSR markers associated with growth-related traits in the Manila clamRuditapesphilippinarum

NIU Hongbo, NIE Hongtao, ZHU Depeng, YANG Feng, YAN Xiwu*

EngineeringandTechnologyResearchCenterofShellfishBreedingofLiaoningProvince,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China

The Manila clam,Ruditapesphilippinarum, which is widely distributed along the coasts of China, is an economically important marine bivalve species in China′s aquaculture industry. The world production of this species was 3.6 million metric tons in 2010. China is the first largest country in the world in terms of production of the Manila clam, producing about 3.0 million metric tons annually, which accounts for about 90% of global production. This species has several pedigrees including White, Zebra, Liangdao Red and Marine Red distributing in the coastal areas in North China. Microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are tandemly repeated motifs of 1—6 genetic base pairs. Microsatellite markers are powerful molecular markers due to their high polymorphism, stability, and co-dominance, and they are used widely in studies of genetic diversity, parentage assignment, genetic linkage map construction, and trait-related marker screening. In this study, 20 microsatellite DNA markers were used to analyze the genetic diversity of 107 individuals of a Zebra F2 pedigree ofR.philippinarum. Forty-one alleles were detected, and the number of alleles (Na) was 2—3 at each locus (average, 2.05). The effective number of alleles (Ne) was 1.71, and the DNA fragment length was 109—430 base pairs. The mean values of observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), and polymorphism information content (PIC) were 0.504, 0.431, and 0.324, respectively. The probability value of the chi-square test showed that three loci significantly deviated from Mendelian segregation (P<0.01), which suggested that these loci might link with the adaptive gene, and two loci (SSR11 and SSR164) may link with recessive homozygous lethal genes. The general linear model procedure in SPSS20.0 was used to analyze the correlation between the 20 microsatellites and growth-related traits ofR.philippinarum(i.e., shell length, shell width, shell height, and body weight). Four loci were significantly related to the growth traits (P<0.05): SSR135 and SSR164 were significantly related to shell width (P<0.05), SSR9 was significantly related to shell height (P<0.05), and SSR142 was significantly related to total weight (P<0.05). Favorable genotypes for each growth trait were identified by a multiple comparison among the loci. Allele A for SSR9 had a significant impact on shell height (P<0.05) and had the highest phenotype value; thus, it can be used as a molecular marker for selective breeding. SSR135 and SSR164 had a significant impact on shell width and total weight (P<0.05), respectively, and allele B for SSR135 and allele A for SSR142 had a positive effect on growth-related traits. The following four genotypes of these loci had a favorable effect on growth-related traits: AA for SSR9, BB for SSR135, AA for SSR142, and AB for SSR164. The trait-related microsatellite loci identified in this study will be valuable for marker-assisted breeding ofR.philippinarum.

Ruditapesphilippinarum; microsatellites; growth-related traits; correlation analysis

國家自然科學(xué)基金(31302183); 國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”項(xiàng)目(2012AA10A400); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-48)

2013-05-16;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305161083

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yanxiwu@dlou.edu

牛泓博，聶鴻濤，朱德鵬，楊鳳，閆喜武.菲律賓蛤仔EST_SSR標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(6):1910-1916.

Niu H B, Nie H T, Zhu D P, Yang F, Yan X W.Identification of EST_SSR markers associated with growth-related traits in the Manila clamRuditapesphilippinarum.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1910-1916.