劉湘慶，王宗靈，李 艷*，宋 偉，范士亮 ，李瑞香，張學雷

(1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 2.中國海洋大學 環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100)

溫度對沉積物中綠藻微觀繁殖體萌發(fā)的影響

劉湘慶1,2，王宗靈1,2，李 艷1,2*，宋 偉1，范士亮1，李瑞香1，張學雷1

(1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 2.中國海洋大學 環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100)

對黃海滸苔綠潮的研究表明，蘇北淺灘及其附近海域是每次綠潮早期發(fā)展的重要區(qū)域，石莼目綠藻微觀繁殖體在該水域大量存在。為研究海水溫度對其萌發(fā)和生長的影響，我們利用2012-10在江蘇近岸如東紫菜養(yǎng)殖區(qū)采集的沉積物樣品，在實驗室進行不同溫度梯度條件(5，10，15，20，25和30 ℃)綠藻微觀繁殖體的培養(yǎng)實驗，并通過PCR-RFLP方法鑒定繁殖體幼苗的種類，分析溫度對不同種綠藻微觀繁殖體萌發(fā)的影響。結果表明：5 ℃的低溫條件下，繁殖體均不能萌發(fā)。10～30 ℃，隨溫度的升高繁殖體萌發(fā)數量呈先增加后降低的趨勢。15和20 ℃時，萌發(fā)數量出現高值，分別平均為17.0和15.8株/g。在研究區(qū)域沉積物中綠藻微觀繁殖體萌發(fā)種類有滸苔、緣管滸苔、盤苔和Ulvasp.1，其萌發(fā)數量的平均值分別為13.7，6.0，2.0和15.4株/g。其中，滸苔萌發(fā)數量隨溫度的升高先升高后降低,在15 ℃時達到最高值為31.2株/g。緣管滸苔在10～20 ℃萌發(fā)數量相對較高, 25 ℃時極低(僅為1.6株/g)，而5和30 ℃時都未能萌發(fā)；Ulvasp.1在10～30 ℃數量變化不明顯，一直保持較高值在15.0株/g左右；盤苔萌發(fā)數量一直較低，在各溫度下均小于3.0株/g。據估算，在蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)(約200 km2)表層沉積物中約有9.8×1013株微觀繁殖體，形成一個巨大的“種子庫”，這將為黃海滸苔綠潮溯源提供數據支撐。

微觀繁殖體；綠潮；溫度；沉積物；蘇北淺灘

綠藻微觀繁殖體是孢子、配子、合子以及顯微個體的統(tǒng)稱[1-2]。自2007年以來，我國黃海海域每年均不同程度地暴發(fā)滸苔綠潮，并且每次起初發(fā)現海面漂浮綠藻都位于江蘇近岸海域[3-4]。該海域是江蘇紫菜養(yǎng)殖的主要海域，整個紫菜養(yǎng)殖區(qū)占地約200 km2[5]。方松等[6]研究表明，該區(qū)域溫度月平均變化范圍在1.8～26.6 ℃，季節(jié)性溫差變化非常大。而且該區(qū)域屬于露漫灘，每天平均有4～6 h會暴露在空氣中，沉積環(huán)境溫度有別于其他區(qū)域，受氣溫影響比較顯著。

微觀繁殖體在綠藻的繁殖和生長中起著非常重要的作用。Worm等[7]人在波羅的海沿岸通過對大型藻類的生長試驗表明，繁殖體庫的存在明顯影響具有快速增殖能力的一年生海藻種群數量。方松等[8]認為微觀繁殖體在適宜的環(huán)境條件下，就會附著萌發(fā)生長成幼苗。Gao等[9]認為滸苔微觀繁殖體能夠附著在綠藻成體上生長，并對漂浮滸苔生物量增加有很大的影響。張華偉等[10]認為微觀繁殖體的大量萌發(fā)會使藻體的生物量增加。并且在現場調查中發(fā)現在成熟的滸苔藻體上附著有萌發(fā)的滸苔幼苗。而溫度等環(huán)境因子對于滸苔屬綠藻微觀繁殖體的萌發(fā)具有重要影響[7,11]。王建偉等[12]認為溫度對水體中滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)具有顯著影響。

目前對蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)沉積物中繁殖體的研究少有報道，尤其是對沉積物中綠藻微觀繁殖體的數量及種類組成、溫度對綠藻微觀繁殖體萌發(fā)的影響缺少清晰的認識。我們通過研究不同溫度對蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)域沉積物中綠藻微觀繁殖萌發(fā)數量及萌發(fā)出的幼苗種類的影響，分析沉積物中綠藻微觀繁殖體的現狀，并探討溫度對于微觀繁殖體室內萌發(fā)生長的影響，以期為江蘇紫菜養(yǎng)殖筏架上定生綠藻來源提供理論基礎，為探討綠藻微觀繁殖體“越冬和度夏”機制提供具體數據支撐。

1 材料與方法

1.1 研究海區(qū)和站位布設

2012-10沉積物采樣，站位于蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)，A站(小洋口)(121°5′23″E，32°40′53″N)、B站(高泥)(121°15′E，32°51′N)、C站(泥螺沙)(121°10′18″E，33°13′27″N)，分別代表3個主要的紫菜養(yǎng)殖區(qū)域(圖1)。

1.2 沉積物樣品采集

沉積物樣品采用插管取樣方法，即待潮水退去后露出底泥，用取樣管(底面積7 cm2，高度7.5 cm)采集表層沉積物。每個站位取3個平行樣，用鋁箔包裹后4 ℃低溫保存，帶回實驗室處理。

1.3 微觀繁殖體培養(yǎng)與計數

首先將取樣管中的沉積物置于玻璃培養(yǎng)皿中，于25倍體式顯微鏡(Leica S6E)下觀察并去除綠藻藻體片段。然后，稱取10 g(約7 cm3)沉積物放入盛有500 mL滅菌海水(S為32)的燒杯中，加入0.5 mL二氧化鍺(質量濃度為0.5 mg/cm3)水溶液和10 mL PES培養(yǎng)液(Provasoli’s enriched Seawater Medium)[13]，然后轉入光照強度為120 μmol/(m2·s)、光暗周期為12L∶12D的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。我們共設計6個溫度梯度(5，10，15，20，25和30 ℃)，每個溫度下設計3個平行樣。培養(yǎng)15 d左右就能觀察到燒杯底和燒杯壁上生長的綠藻幼苗，長度為1～3 cm，并記錄每個燒杯中綠藻的幼苗數量。

1.4 DNA提取、PCR擴增和RFLP分析

從每個燒杯中隨機選取10～15株綠藻幼苗進行分子檢測，確定其屬種，共計140個樣品。首先將綠藻藻體用去離子水漂洗3次。然后，用EZNATM HP植物DNA試劑盒提取植株DNA。

根據Leskinen和Hayden等人的方法[14-15]進行ITS序列的擴增，其中包括ITS1，5.8S和ITS2的擴增。由于ITS序列的多態(tài)性[16]不能夠區(qū)分LPP進化枝(linza-prolifera-procera)中的U.prolifera和U.linza的分支，因此根據Lin等[17]使用的引物對5S間隔區(qū)進行擴增：正向5'-GGTTGGGCAGGATTAGTA-3'和反向5'-AGGCTTAAGTTGCGAGTT-3'。ITS和5S區(qū)域的PCR產物分別用質量分數為1%和2%的瓊脂糖凝膠分離，通過5S rDNA間隔區(qū)可以區(qū)分出緣管滸苔和滸苔種[18]。

ITS PCR擴增的產物分別經4種限制性內切酶BspT107 I，EcoO109 I，Hin1 I and VpaK11B I酶切成小片段，并通過質量分數為3%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外光下顯色，根據ITS序列的RFLP電泳圖譜區(qū)分不同的綠藻種類[18]。

2 結 果

2.1 微觀繁殖體的萌發(fā)數量

不同溫度下綠藻微觀繁殖體萌發(fā)數量明顯不同，5 ℃的低溫條件下，A，B，C三個站位表層沉積物中的綠藻微觀繁殖體均不能萌發(fā)生長。10 ℃時，綠藻微觀繁殖體萌發(fā)數量為2.4～13.4株/g，其平均值為7.9株/g；15 ℃時，為5.5～27.9株/g，其平均值為17.0株/g；20 ℃時，為7.6～18.9株/g，其平均值為15.8株/g；25 ℃時，為1.7～12.3株/g，其平均值為8.7株/g；30 ℃時，為2.3～12.0株/g，其平均值為7.7株/g。在10～30 ℃，沉積物中綠藻微觀繁殖體萌發(fā)數量呈現出隨著溫度的升高先增多后減少的趨勢，在15 ℃和20 ℃較適宜其萌發(fā)(圖2)。

在不同站位繁殖體萌發(fā)數量也表現出一定差異，A站位綠藻微觀繁殖體萌發(fā)數量在20 ℃時出現最大值(7.6株/g)，平均值為3.9株/g；B站位也在20 ℃時出現最大值(21株/g)，平均值為13.5株/g。C站位則在15 ℃時出現最大值(27.9株/g)，平均值為16.9株/g。

圖2 微觀繁殖體的萌發(fā)數量Fig.2 Germinating number of microscopic propagules in different sampling stations

2.2 溫度對不同種綠藻微觀繁殖體萌發(fā)的影響

通過PCR-RFLP分析，鑒別出滸苔(Ulvaprolifera)、緣管滸苔(Ulvalinza)、盤苔(Blidingiasp.)和Ulvasp.1共四種綠藻(圖3a中5,8和9為LPP分支，2，4，6和7為Ulvasp., 1,3為盤藻；圖3b中2和3為滸苔，4和5為緣管滸苔)。其萌發(fā)數量的平均值分別為13.7，6.0，2.0和15.4株/g。

5 ℃的低溫條件下，綠藻微觀繁殖體均不能萌發(fā)生長。10 ℃時，滸苔、緣管滸苔和Ulvasp.1的萌發(fā)數量分別為7.8，6.6和11.6株/g。15 ℃時，滸苔的萌發(fā)數量迅速增加達到31.2株/g，為6個溫度梯度下的最高值；其次是Ulvasp.1，為15.8株/g，較10 ℃略有上升；而緣管滸苔僅為4.1株/g，略有下降。20 ℃時，滸苔的萌發(fā)數量減少到19.5株/g，而緣管滸苔上升至11.9株/g，Ulvasp.1較平穩(wěn)為16.2株/g。25 ℃時，滸苔的萌發(fā)數量繼續(xù)下降，為8.6株/g；緣管滸苔也迅速下降，為1.6株/g；Ulvasp.1保持穩(wěn)定，為14.3株/g；盤苔較低，為1.6株/g。30 ℃時，滸苔的萌發(fā)數量持續(xù)降低，為1.4株/g；緣管滸苔為零，已不適宜其萌發(fā)；Ulvasp.1略有上升，為19.2株/g；盤苔也有小范圍上升，為2.5株/g。

滸苔繁殖體萌發(fā)數量隨溫度的變化呈現先升高后降低的正態(tài)分布。緣管滸苔萌發(fā)數量隨溫度的變化略有波動，在10～20 ℃時的數量較高，而在高溫環(huán)境中其萌發(fā)數量較低或不萌發(fā)。Ulvasp.1的萌發(fā)數量受溫度變化的影響較小，在10～30 ℃萌發(fā)數量穩(wěn)定在11.6～19.2株/g。盤苔僅在25 ℃和30 ℃時能夠萌發(fā)生長，但萌發(fā)數量較少。

圖3 4種綠藻的RFLP分析結果Fig.3 The RFLP results of four green algae

圖4 不同溫度對綠藻繁殖體萌發(fā)數量的影響Fig.4 Effect of different temperatures on germinating number of microscopic propagules

3 討 論

3.1 溫度對綠潮微觀繁殖體萌發(fā)的影響

對大型綠藻的研究表明，溫度對于綠藻的生長率有至關重要的作用[19-20]，且不同種類對溫度的喜好表現略有差異。吳洪喜等[21]研究水溫對滸苔的影響發(fā)現，滸苔系溫帶海藻，生長適宜水溫為10～30 ℃，最適水溫為15～25 ℃。張曉紅等[22]人對滸苔生長率的研究證實，在20 ℃其特定生長率達到最高。Kim等[23]通過溫度對緣管滸苔的研究表明，在10～15 ℃的低溫條件下藻體具有較高的光合速率。Taylor等[19]研究溫度等環(huán)境因子對大藻生長率的影響表明，緣管滸苔在10～20 ℃的生長率較高，25 ℃以上生長率明顯降低。Deng等[24]對硬毛藻屬Chaetomorpha大型綠藻的研究表明，其在21～29 ℃的條件下最適C.valida的生長。不同溫度條件下，滸苔、緣管滸苔和C.valida生長率比較結果明確顯示，15～25 ℃滸苔的生長率明顯高于其他大型綠藻(圖5)。

圖5 3種大型綠藻生長率比較Fig.5 Growth rates of three green macroalgae

溫度對不同種綠藻微觀繁殖體的萌發(fā)有顯著影響。滸苔繁殖體適宜在15～20 ℃萌發(fā)，其萌發(fā)溫度與藻體最適生長溫度基本一致。而緣管滸苔繁殖體萌發(fā)數量隨溫度的升高呈現一定的波動性，與滸苔比較，緣管滸苔繁殖體適于在10～20 ℃萌發(fā)生長。Ulvasp.1在10～30 ℃的萌發(fā)數量均較高，在15株/g左右。盤苔繁殖體萌發(fā)數量一直很低，在各個溫度下均小于5株/g。

3.2 沉積物中繁殖體在綠潮發(fā)生中的作用

方松等[6]研究表明，在20 ℃培養(yǎng)條件下，2011年秋季A站和B站沉積物中綠藻繁殖體數量小于25株/g，而C站的數量則明顯較多，為47株/g。我們在20 ℃培養(yǎng)條件下的結果與方松等人的結果基本一致，說明在如東紫菜養(yǎng)殖區(qū)沉積物中始終存在綠藻微觀繁殖體。

綠藻微觀繁殖體在江蘇紫菜養(yǎng)殖區(qū)的沉積物中大量存在，按實驗得出的沉積物中綠藻微觀繁殖體數量平均為34.3株/g，即49株/cm2。以紫菜養(yǎng)殖區(qū)的面積約200 km2計算[3]，我們可以估算出整個養(yǎng)殖區(qū)沉積物表層7.5 cm厚度的沉積物中微觀繁殖體的總數量，即整個養(yǎng)殖區(qū)沉積物中約有9.8×1013株的綠藻微觀繁殖體。由此可見，蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)沉積物是一個巨大的綠藻微觀繁殖體庫，應當是紫菜筏架上定生綠藻的主要來源。

Lotze等[11]認為，形成水華的一年生海藻能夠通過形成繁殖體庫的形式度過寒冷的冬季，并作為來年春季暴發(fā)水華的“種子”來源。我國江蘇如東紫菜養(yǎng)殖區(qū)的沉積物同樣也成為一個巨大的儲存庫，使裸露的微小的綠藻繁殖體得以度過寒冷冬季，在次年溫度適宜時，這些微小的綠藻繁殖體便在養(yǎng)殖設施上附著萌發(fā)生長。

4 結 論

通過江蘇近岸紫菜養(yǎng)殖區(qū)沉積物中綠藻微觀繁殖體的室內溫度梯度培養(yǎng)實驗，分析了重要環(huán)境因子溫度對綠藻微觀繁殖體萌發(fā)數量和種類的影響，主要結論：

1)溫度對沉積物中繁殖體萌發(fā)數量有顯著影響，5 ℃的低溫條件下，繁殖體均不能萌發(fā)。15和20 ℃時，萌發(fā)數量出現高值，分別為17.0和15.8株/g。10，25和30 ℃的萌發(fā)數量相當，在8.0株/g上下?？傮w上，隨溫度的升高繁殖體萌發(fā)數量呈先增加后降低的趨勢。

2)在研究區(qū)域沉積物中綠藻微觀繁殖體萌發(fā)種類有滸苔、緣管滸苔、盤苔和Ulvasp.1，其萌發(fā)數量的平均值分別為13.7，6.0，2.0和15.4株/g。其中，滸苔萌發(fā)數量隨溫度的升高先升高后降低,在15 ℃時達到最高值為31.2株/g。緣管滸苔在10～20 ℃萌發(fā)數量相對較高, 25 ℃時極低僅為1.6株/g，而5和30 ℃時都未能萌發(fā)。Ulvasp.1在10～30 ℃數量變化不明顯，一直保持較高值在15.0株/g左右。而盤苔萌發(fā)數量一直較低，在各溫度下均小于3.0株/g。

3)蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖區(qū)(面積約200 km2)表層沉積物中存在一個巨大的綠藻微觀繁殖體庫，經估算，約有9.8×1013株綠藻微觀繁殖體，是紫菜養(yǎng)殖筏架上定生綠藻的潛在來源。

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Received: January 20, 2014

Effects of Temperature on the Germination of Green Algal Micro-propagules in the Sediment

LIU Xiang-qing1,2, WANG Zong-ling1,2, LI Yan1,2, SONG Wei1,FAN Shi-liang1, LI Rui-xiang1, ZHANG Xue-lei1

(1.TheFirstInstituteofOceanography,SOA， Qingdao 266061, China;2.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,OceanUniversityofChina, Qingdao 266100, China)

Subei Shoal and its adjacent waters are important area for early development ofUlvaproliferagreen tides in southern Yellow Sea. It has proved that the micro-propagules were extensively distributed in this water area and the sea water temperature could influence the germination and growth of micro-propagules. The effects of temperature (5,10,15,20,25 and 30 ℃) on the species and germinating quantity of micro-propagules of green algae in the sediment samples were studied in our laboratory using the samples collected fromPorphyraaquaculture area in the southern Jiangsu province in October 2012. Results show that the algae micro-propagules failed to geminate in 5 ℃. With the water temperature rose from 10 ℃ to 30 ℃, the quantity of micro-propagules had a trend of first increase and then decrease, its peak was recorded at 15 ℃ and 20 ℃,being 17.0 ind./g and 15.8 ind./g, respectively. These micro-propagules were identified asUlvaprolifera,Ulvalinza,Ulvasp.1 andBlidingiasp. by PCR-RFLP, the average amount of them were 13.7 ind./g, 6.0 ind./g, 2.0 ind./g and 15.4 ind./g. Among them, the amount of micro-propagules ofUlvaproliferareached the peak at 15 ℃, being 31.2 ind./g, and those ofUlvalinzawere higher at 10～20 ℃, diminished to 1.6 ind./g at 25 ℃ and did not germinate at 5 ℃ or 30 ℃. The micro-propagules ofUlvasp. 1 maintained high amount at 10～30 ℃, being 15 ind./g and those ofBlidingiasp. were in low amount in all temperature, being about 3 ind./g. Accordingly, it was estimated that approximately 9.8×1013ind. micro-propagules would be existed in the sediment ofPorphyraaquaculture area in Subei Shoal (about 200 km2), which will constitute a huge seed bank of green algae. This study will contribute data to support the traceability of green tide in the Yellow Sea.

micro-propagules; green tides; temperature; sediment; Subei Shoal

2014-01-20

國家重點基礎研究發(fā)展計劃——我國近海藻華災害演變機制與生態(tài)安全(2010CB428703)；國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項——紫菜筏架區(qū)綠藻防控技術研究與示范(201105023-2)；青島市公共領域科技支撐計劃——黃海滸苔綠藻起源、發(fā)生與發(fā)展過程調查研究(11-3-1-7-hy)

劉湘慶(1989-)，男，山東青島人，博士研究生，主要從事海洋生態(tài)學方面研究.E-mail：adslalxq@163.com

*通訊作者：李 艷(1974-)，女，山東定陶人，副研究員，博士研究生，主要從事浮游植物分類學方面研究.E-mail：liyan@fio.org.cn

(高 峻 編輯)

Q178

A

1671-6647(2015)01-0219-08