孫 敏，唐小千，趙 娜，繩秀珍，戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

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海豚鏈球菌胞外產物的抗原性及免疫保護效果研究*

孫 敏，唐小千，趙 娜，繩秀珍**，戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

以健康牙鲆(Paralichthysolivaceus)為攻毒對象，檢測了5株海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)菌株的毒力特性。結果顯示，菌株NUF849、NUF812、NUF701、NUF693和NUF633對牙鲆的半數致死濃度分別為3.0×105、1.1×106、4.2×107、1.2×107和2.4×107CFU/mL。以平板玻璃紙法分別制備5株海豚鏈球菌的胞外產物，SDS-PAGE分析其蛋白組成。結果顯示，5株海豚鏈球菌胞外產物均存在14、20、27、30、38、46、57和68kDa等主要蛋白條帶，而36kDa蛋白條帶僅存在于毒力較強的NUF849、NUF812和NUF693菌株。以強毒株NUF849的胞外產物免疫健康牙鲆，并在免疫后28d進行攻毒，取攻毒后存活牙鲆的血清對5株海豚鏈球菌的胞外產物進行western-blot檢測。結果顯示，制備的抗血清可與5株菌共有的46、50、62及88kDa蛋白條帶發(fā)生陽性反應。以制備的強毒株NUF849和弱毒株NUF701胞外產物分別免疫牙鲆，在免疫后42d以菌株NUF812對免疫牙鲆進行攻毒。結果顯示，菌株NUF849和NUF701胞外產物對牙鲆感染的相對免疫保護率分別為32.4%和16.2%。研究結果為揭示海豚鏈球菌胞外產物的毒力特性和亞單位疫苗候選蛋白的篩選提供了參考數據。

海豚鏈球菌；牙鲆；胞外產物；抗原性；免疫保護

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)是養(yǎng)殖魚類的重要細菌性病原，可感染多種海水和淡水魚類，由其引發(fā)的疾病在世界范圍內均有暴發(fā)與流行，常見于養(yǎng)殖的牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、鰤魚(Naucratesductor)、美國紅魚(Sciaenopsocellatus)、羅非魚(Oreochromisnilotica)、虹鱒(Oncorhychusmikiss)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等[1-7]，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。在眾多的魚類疾病防治措施當中，接種疫苗不僅可以有效防控魚類傳染性疾病的發(fā)生，同時又能避免微生物產生耐藥性，降低水體污染等問題，已逐漸發(fā)展成為魚類疾病防控的主流手段[8-9]。然而，要研制切實有效的海豚鏈球菌疫苗，就需要對該菌的毒力特性及其致病機理等方面進行深入的研究。

胞外產物(Extracellular products, ECPs)是細菌在生長與繁殖過程中不斷向環(huán)境中釋放的代謝產物，主要含有各類活性酶和毒素等，目前已有報道的鏈球菌胞外產物主要有蛋白酶、DNA酶、透明質酸酶、溶血素、3-磷酸甘油脫氫酶、類M蛋白、纖連蛋白、烯醇化酶及溶血素等[10]，它們是鏈球菌致病力的重要組成部分，同時具有良好抗原性，因此是制備亞單位與基因疫苗的重要候選材料。另有研究顯示，同種細菌的不同分離株在胞外產物的組成、含量及其致病力方面會存在一定差異[11-13]，因此通過比較研究各毒力差異菌株胞外產物的組成情況，可為深入了解細菌各胞外產物組分的活性及其致病力與致病機理提供重要參考，同時也將為細菌亞單位及基因疫苗的開發(fā)提供基礎數據。然而，目前有關海豚鏈球菌不同菌株間的胞外產物組成差異情況及其與致病力之間的相互性研究卻少有涉及。為此，本研究選擇5株海豚鏈球菌對其毒力特性進行檢測，分析其胞外產物的蛋白組成及抗原性，同時比較了強毒株與弱毒株胞外產物的免疫保護效果，以期為了解鏈球菌致病特性及篩選亞單位疫苗候選組分提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與菌株

健康牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場，體重(20±5)g，蓄養(yǎng)于40cm×40cm×70cm水槽內，水溫(23±1)℃，全天充氣，日換水2/3，每日投喂1%魚體重的飼料，暫養(yǎng)7d后用于實驗。所用的5株海豚鏈球菌菌株NUF849、NUF812、NUF701、NUF693和NUF633由實驗室保藏[14]。

1.2 攻毒試驗

為了檢測5株海豚鏈球菌對牙鲆的毒力特征，將凍存的鏈球菌經血平板28℃活化24h后轉接于腦心浸液(BHI)瓊脂平板富集培養(yǎng)，以0.01mol/L無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗脫，3000g離心15min，重復3次，棄上清，以無菌PBS將5株菌的濃度分別調整為1.0×109、1.0×108、1.0×107、 1.0×106及1.0×105CFU/mL，腹腔注射牙鲆，每尾0.1mL，每個濃度組20尾。對照組注射等量無菌PBS。攻毒后連續(xù)觀察14d，記錄各組的死亡情況，以改良寇氏法計算半數致死濃度(LD50)[15]。

1.3 胞外產物的制備

采用平板玻璃紙法制備胞外產物[16]，具體步驟為將活化后的菌株接種于BHI肉湯，28℃靜置培養(yǎng)24h；取1mL液體培養(yǎng)物涂布于鋪覆滅菌玻璃紙的BHI平板(直徑15cm)，28℃培養(yǎng)60h；無菌PBS洗下菌苔，收集菌懸液離心(8000g，20min，4℃)；上清經0.22μm微孔濾膜除菌，并以截留分子量為8～14kDa的透析袋于超純水中4℃透析，凍干，以PBS重懸，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后，分裝貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牙鲆抗血清的制備

將制備的菌株NUF849的胞外產物蛋白濃度調整至2mg/mL，然后與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)混合，腹腔注射免疫牙鲆，每尾注射0.2mL。在免疫后第28d，以1.0×108CFU/mL的菌株NUF849對免疫牙鲆進行攻毒，每尾注射0.1mL。7d后對存活的牙鲆進行尾靜脈取血，將血液于室溫靜置1h，4℃靜置過夜，3000g離心30min獲取抗血清，分裝于-80℃保存。以相同方法獲取健康牙鲆血清。

1.5 SDS-PAGE與Western-blot

對制備的5株海豚鏈球菌的胞外產物在兩塊平行凝膠上進行SDS-PAGE，每泳道上樣10μg，將其中一塊凝膠以考馬斯亮藍G-250進行染色，脫色后觀察各菌株胞外產物蛋白的組成情況。另一凝膠電轉移至0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜，轉移后將膜用以PBS配置的5%脫脂奶粉在37℃條件下封閉1h；PBST(含0.05%吐溫-20的PBS)洗滌后，加入以PBS稀釋50倍的牙鲆抗菌株NUF849胞外產物的血清，37℃孵育1h；PBST洗滌后，加入實驗室前期研制的鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體[17]，37℃孵育1h；PBST洗滌后，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG(1:5000，v/v)在37℃條件下孵育1h。以PBST洗滌后，加入新鮮配制的四氮唑藍/5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸鹽(NBT/BCIP)發(fā)色液，室溫暗處顯色。以健康牙鲆血清代替牙鲆抗血清作為對照。

1.6 免疫保護試驗

為了比較海豚鏈球菌不同菌株胞外產物對牙鲆的免疫保護效果，分別以菌株NUF849及NUF701的胞外產物免疫牙鲆，免疫方式如1.4部分所述，以注射等體積的 PBS作為對照，每組40尾牙鲆。在免疫后第42天，各免疫組牙鲆分別以菌株NUF812進行攻毒，腹腔注射0.1mL濃度為1×108CFU/mL的菌液，連續(xù)觀察20d并統(tǒng)計死亡情況，按下列公式計算相對免疫保護率(RPS)：

RPS (% ) = (對照組死亡率-免疫組死亡率) /對照組死亡率×100%。

2 結果

2.1 5株海豚鏈球菌的毒力特征

基于攻毒試驗各濃度組的死亡率結果計算得知，海豚鏈球菌菌株NUF849、NUF812、NUF701、NUF693和NUF633對牙鲆的LD50分別為3.0×105、1.1×106、4.2×107、1.2×107和2.4×107CFU/mL(見表1)。根據各株鏈球菌對健康牙鲆的毒力差異情況判定得知，NUF849和NUF812為毒力較強的菌株，NUF701、NUF693和NUF633為毒力較弱的菌株。

表1 5株海豚鏈球菌對牙鲆的毒力特征Table 1 The virulence of 5 S. iniae strains against P.olivaceus

2.2 5株海豚鏈球菌胞外產物蛋白組成分析

SDS-PAGE結果顯示，5株海豚鏈球菌胞外產物的蛋白組成具有較高的相似度，約有20多條蛋白條帶，主要集中在分子量為25～66kDa的區(qū)間范圍內，它們都具有分子量為14、20、27、30、38、46、57和68kDa等主要蛋白條帶。但是，在毒力較強的NUF849、NUF812與NUF693菌株中均有一條分子量約為36kDa的蛋白條帶，而毒力較弱的NUF701和NUF633菌株中此蛋白條帶不明顯(見圖1)。

圖1 5株海豚鏈球菌胞外產物的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of ECPs of 5 S. iniae strains

2.3 5株海豚鏈球菌胞外產物的抗原性分析

Western-blot結果顯示，通過免疫菌株NUF849胞外產物制備的牙鲆抗血清可與5株菌胞外產物的多條蛋白發(fā)生陽性反應，發(fā)生反應的條帶分子量集中分布于25～66kDa范圍內，其共同的抗原反應條帶的分子量分別為46、50、62和88kDa，另外抗血清可與除弱毒菌株NUF693以外的4株鏈球菌的24、30及38kDa的蛋白發(fā)生明顯的陽性反應(見圖2)。以陰性牙鲆血清作為對照的western-blot分析結果顯示，健康牙鲆血清僅可與弱毒株NUF693與NUF633中分子量為60kDa蛋白條帶發(fā)生較為明顯的反應(見圖3)。

2.4 菌株NUF849與NUF701胞外產物的免疫保護效果

為了比較海豚鏈球菌不同菌株胞外產物對牙鲆的免疫保護效果，分別以菌株NUF849及NUF701的胞外產物免疫牙鲆，以注射PBS作為對照，在免疫后第42天，各免疫組牙鲆分別以菌株NUF812進行攻毒。攻毒后，注射PBS組牙鲆在攻毒后第2天便開始出現死亡，直至攻毒后第17天死亡率達到92.5%。然而，免疫強毒株NUF849胞外產物的牙鲆在攻毒后，死亡率顯著低于對照組，直至感染后第17天死亡率為62.5%，其相對免疫保護率為32.4%，免疫弱毒株NUF701胞外產物的牙鲆在攻毒后，死亡率顯著略高于強毒株免疫組牙鲆，直至感染后第17天死亡率為77.5%，其相對免疫保護率為16.2%(見圖4)。免疫組與對照組死亡牙鲆表現出典型鏈球菌感染癥狀，即體色發(fā)黑、解剖可見黃色或血樣腹水，肝臟充血，脾腫大，腎臟色深，腸腔積液。

圖2 牙鲆抗菌株NUF849胞外產物血清與5株海豚鏈球菌胞外產物反應的Western-blot結果Fig.2 Western-blot of ECPs of 5 S. iniae strains using antiserum against ECPs of strain NUF849

圖3 牙鲆陰性血清與5株海豚鏈球菌胞外產物反應的Western-blot結果Fig.3 Western-blot of ECPs of 5 S. iniae strains using negative serum

圖4 牙鲆免疫NUF849和NUF701胞外產物后再經NUF812菌株攻毒的累計死亡率曲線Fig.4 The mortality curve of P. olivaceus challenged with strain NUF812 after pre-immunization with ECPs of strain NUF849 and NUF 701

3 討論

利用毒力差異菌株在蛋白和基因水平上開展對比研究是揭示其毒力關鍵因子及其致病特性的重要技術途徑[18-21]。本研究選取了5株海豚鏈球菌進行攻毒試驗，結果顯示其對牙鲆的半致死濃度存在顯著差異，推測其毒力大小差異可能與菌株毒力因子的分泌種類、含量及調控機制等存在密切聯系。進而對分離的5株鏈球菌胞外產物的蛋白組成進行了分析，結果顯示5株海豚鏈球菌胞外產物在組成上具有較高的同源性，存在多條共有蛋白條帶，但是分子量為36kDa的蛋白條帶僅存在于毒力較強的NUF849、NUF812和NUF693菌株胞外產物中，推測其可能與海豚鏈球菌的毒力存在密切關系，有待對其開展進一步的分子鑒定與特性分析研究。曾有研究發(fā)現海豚鏈球菌胞外產物的組成與菌株毒力之間存在密切相關性[22]。為了進一步驗證不同菌株間胞外產物的差異性，本文分別以強毒株NUF849與弱毒株NUF701的胞外產物免疫牙鲆，以另一強毒株NUF812進行攻毒，結果顯示強毒株NUF849胞外產物對牙鲆的相對免疫保護率顯著高于弱毒株NUF701，結果表明海豚鏈球菌不同毒力株在胞外產物的組成及其各組分豐度上存在一定差別，進而使各免疫組牙鲆表現出不同的免疫保護力。

Western-blot分析結果顯示，制備的牙鲆抗菌株NUF849血清可與5株海豚鏈球菌共有的46、50、62及88kDa蛋白條帶發(fā)生陽性反應，同時還可以與強毒株NUF849及NUF812的24、30及38kDa等主要蛋白條帶發(fā)生陽性反應，這些共有條帶可作為制備具有交叉免疫保護效果疫苗的候選材料。另外，本研究還發(fā)現海豚鏈球菌弱毒株NUF693與NUF633有一分子量約為60kDa的條帶可與陰性牙鲆血清發(fā)生陽性反應，推測其可能為鏈球菌的Ig結合蛋白，由于前期研究已證實部分鏈球菌在其細胞壁表面存在鏈球菌G蛋白，它能特異性結合IgG的Fc端[23]。

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責任編輯 朱寶象

Studies on the Antigenicity and Immunoprotecive Efficacy of Extracellular Products from Some Strains of Streptococcus iniae

SUN Min, TANG Xiao-Qian, ZHAO Na, SHENG Xiu-Zhen, ZHAN Wen-Bin

(The Key Laboratory of Mariculture of Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The virulence of 5Streptococcusiniaestains against healthy flounder (Paralichthysolivaceus) was tested through challenge experiment. The results showed thatLD50of strain NUF849, NUF812, NUF701, NUF693 and NUF633 was 3.0×105, 1.1×106, 4.2×107, 1.2×107and 2.4×107CFU/mL, respectively. The extracellular products (ECPs) of the five stains ofS.iniaewere obtained using cellophane plate culture technique with their protein composition profiled through SDS-PAGE. Eight distinct bands with molecular weight (MW) of 14, 20, 27, 30, 38, 46, 57 and 60kDa were detected in five strains; however, a band with MW of 36kDa was only detected in more virulent strains including NUF849, NUF812 and NUF693. Healthy flounder were vaccinated with the ECPs from more virulent strain NUF849, and the anti-sera were obtained from the vaccinated and NUF849 challenge survived fish individuals. Western-blotting showed that the anti-sera could react with four common bands of the ECPs (46, 50, 62 and 88kDa) from 5S.iniaestrains. Healthy flounder were vaccinated with the ECPs from NUF849 and NUF701, respectively. On day 42 post-vaccination, flounder were challenged with strain NUF812, and the relative percentage survival (RPS) of NUF849 and NUF701 ECPs vaccinated groups were 34.2% and 16.2%, respectively.Our results provided primary data for illustrating the viru-lence characteristics ofS.iniaeECPs and the screening of subunit vaccine candidates.

Streptococcusiniae;Paralichthysolivaceus; extracellular proteins; antigenicity; immune protection

國家自然科學基金項目(31172429；31302216)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B01)；山東省自然科學基金項目(ZR2011CQ022)資助

2014-02-20;

2014-05-03

孫 敏(1988-)，女，碩士生，從事水產動物病害與免疫學研究。E-mail：smfelicia@163.com

** 通訊作者： E-mail：xzsheng@ouc.edu.cn

S94

A

1672-5174(2015)04-035-05

10.16441/j.cnki.hdxb.20140038