張新研

（遼寧省撫順市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，撫順 113008）

近幾年的調(diào)查結(jié)果顯示，白念珠菌為一種條件致病菌，是引起院內(nèi)感染的常見菌種，并且感染發(fā)生率有逐年增加的趨勢(shì)。經(jīng)分析出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因?yàn)樵摼苋菀桩a(chǎn)生生物哦，并且生物膜的形成很容易引起藥物療效的打折?，F(xiàn)階段臨床上西藥抗白念珠菌生物膜的研究獲得了一定的成效，而對(duì)于中藥抗生物膜的研究報(bào)道則相對(duì)較少。黃連解毒湯在中醫(yī)臨床上屬于常用的清熱解毒基礎(chǔ)方，主要功效為清熱解毒、清熱化濕，為對(duì)病原菌感染進(jìn)行治療的常用方藥。本次研究中出于對(duì)黃連解毒湯和單味藥在體外對(duì)白念珠菌生物膜的影響進(jìn)行對(duì)比分析，為今后的研究與臨床工作提供有價(jià)值的參考信息的目的，采取MTT法對(duì)白念珠菌的懸浮菌、生物膜對(duì)黃連解毒湯、單味藥的敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 菌株為20株白念珠菌。實(shí)驗(yàn)藥物包括：黃連解毒湯。按照國(guó)家中醫(yī)藥管理局統(tǒng)一組織編審的普通高等教育中醫(yī)類規(guī)劃教材《方劑學(xué)》中的藥物組成，復(fù)方與其單味藥黃柏、黃芩、黃連、梔子。復(fù)方與單味藥均水煎兩次后，合并濃縮至100%濃度的藥業(yè)，離心處理取上清濾過除菌，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基包括：RPMI1640培養(yǎng)基，YPG培養(yǎng)基以及沙氏培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)試劑包括：結(jié)晶紫，MTT，DMSO。是均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器包括：318-酶標(biāo)儀，96孔平板，倒置顯微鏡，均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2 .1 MIC的測(cè)定 以NCCLS的M27-A方案為依據(jù)，將100 μl的0.5×103～2.5×103個(gè)細(xì)胞/ml菌體混懸液加入至96孔板中，96孔板中事先已經(jīng)加入而被稀釋濃度的藥物，在37℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，將無菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為個(gè)菌株的最低抑菌濃度。

1.2 .2 白念珠菌生物膜的制備 將所得到的白念珠菌在YPG培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，在37℃搖床過夜培養(yǎng)后對(duì)菌體進(jìn)行收集，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后，對(duì)菌液濃度調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/ml。取100 μl的菌懸液在96孔板中接種，在37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，保證白念珠菌能夠完全在平底的96孔板基底表面黏附，從而形成白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)，倒置顯微鏡下對(duì)白念珠菌生物膜的形成進(jìn)行鑒定。

1.2.3 SMIC的測(cè)定 在形成生物膜后，將培養(yǎng)基以及懸浮菌棄去，經(jīng)PBS進(jìn)行反復(fù)清洗3次，將藥物按照兩倍稀釋后加入到各孔中，連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，MTT法對(duì)抑制生物膜50%以及90%的藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)。而后將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，經(jīng)PBS反復(fù)清洗3次，佳兒DMSO100μl，連續(xù)振蕩5分鐘后，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)條件下對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè)。將未加藥物的孔作為對(duì)照組。

1.2 .4 預(yù)處理96孔板作用的觀察 采取無菌PBS將黃連解毒湯以及各單味藥按照而被連續(xù)稀釋后加入到96孔板中，每孔200μl，在4℃條件下過夜保存。將藥物棄去后，經(jīng)PBS清洗1次，每孔中加入菌液100μl，在37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，將孔內(nèi)的菌液吸出，PBS反復(fù)清洗3遍，MTT法對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 本次實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采取Graphpad Prism 4.03統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件student’s檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 MIC和SMIC檢測(cè)結(jié)果比較 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，黃柏、黃芩對(duì)白念珠菌懸浮菌的MIC50、MIC90以及對(duì)白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90與黃連解毒湯比較無明顯差異；而黃連MIC50、MIC90以及對(duì)白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90與黃連解毒湯比較發(fā)生明顯降低，并且低于黃柏和黃芩，見表1。

表1黃連解毒湯組方對(duì)白念珠菌的MIC以及念珠菌生物膜SM IC檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì) （mg/m l）

2.2 96 孔板預(yù)先藥物包被對(duì)白念珠菌生物膜的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照孔比較，復(fù)方、單味黃連、黃柏、黃芩的藥物濃度在達(dá)到≥6.25 mg/ml時(shí)，藥物預(yù)先包被96孔板對(duì)白念珠菌生物膜形成均存在明顯抑制作用，但存在明顯差異，表現(xiàn)為黃柏、黃芩對(duì)體外白念珠菌生物膜抑制作用與黃連解毒湯效果相近，但黃連的抑制效果更加的明顯。梔子無抑制效果，見圖1。

圖1藥物預(yù)先包被對(duì)白念珠菌生物膜的影響

3 討論

調(diào)查結(jié)果顯示，隨著臨床上各種體內(nèi)裝置譬如說人工心臟瓣膜、靜脈插管以及關(guān)節(jié)置換術(shù)等的廣泛應(yīng)用，使得真菌感染的發(fā)生率逐年升高，特別是白念珠菌感染情況日益嚴(yán)峻，抗菌藥物的不合理應(yīng)用也使得病原菌耐藥性逐漸增強(qiáng)。研究中發(fā)現(xiàn)，在難治性真菌感染的病灶中多存在生物膜感染源，生物膜時(shí)附著在活組織或者是無活力組織表面的、由自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，為相對(duì)單個(gè)分散的懸浮狀態(tài)菌細(xì)胞而言的微生物另外一種獨(dú)特生存形式，生物膜的形成會(huì)使病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性降低，甚至?xí)a(chǎn)生耐藥。

本次研究中出于對(duì)黃連解毒湯和單味藥在體外對(duì)白念珠菌生物膜的影響進(jìn)行對(duì)比分析，采取MTT法對(duì)白念珠菌的懸浮菌、生物膜對(duì)黃連解毒湯、單味藥的敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃柏、黃芩對(duì)白念珠菌懸浮菌的MIC50、MIC90以及對(duì)白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90與黃連解毒湯比較無明顯差異；而黃連MIC50、MIC90以及對(duì)白念珠菌生物膜的SMIC50、SMIC90與黃連解毒湯比較發(fā)生明顯降低。與對(duì)照孔比較，復(fù)方、單味黃連、黃柏、黃芩的藥物濃度在達(dá)到≥6.25 mg/ml時(shí)，藥物預(yù)先包被96孔板對(duì)白念珠菌生物膜形成均存在明顯抑制作用，黃柏、黃芩與黃連解毒湯效果相近，黃連的抑制效果更加的明顯。梔子無抑制效果。這一結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相似，由此證實(shí)，黃柏、黃芩對(duì)體外白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用，并與黃連解毒湯效果相近，黃連的抑制效果更加的明顯。在今后的研究與臨床工作中應(yīng)對(duì)其給予足夠的重視。

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