李宏波　趙立斌

二元信號(hào)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

李宏波趙立斌

【關(guān)鍵詞】二元信號(hào)系統(tǒng);組氨酸激酶;應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白;抗生素耐藥性;抑制劑

作者單位: 066300河北省撫寧縣人民醫(yī)院

二元信號(hào)系統(tǒng)(two-component signaling system，TCSS)是一種普遍存在于細(xì)菌中的重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，也是基因表達(dá)的重要調(diào)控系統(tǒng)［1，2］。病原菌在感染宿主的過程中，能通過該系統(tǒng)密切感受和應(yīng)答體內(nèi)外各種微環(huán)境的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)以完成其致病過程［3］。因此，全面系統(tǒng)地了解和掌握TCSS的結(jié)構(gòu)功能和作用機(jī)制及病原菌毒力基因、耐藥基因等的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，將大大地促進(jìn)我們對(duì)病原菌致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，也有助于我們深入地了解細(xì)菌耐藥性形成機(jī)制，為臨床診斷、治療和預(yù)防病原菌感染提供依據(jù)，為開發(fā)新型抗細(xì)菌耐藥性藥物提供指導(dǎo)。

1　概述

1.1二元信號(hào)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)二元信號(hào)系統(tǒng)(TCSS)在病原菌中起著“神經(jīng)系統(tǒng)”的作用，是細(xì)菌感受和應(yīng)答外界信號(hào)的物質(zhì)基礎(chǔ)。它主要由接受并傳遞信號(hào)的跨膜組氨酸激酶(histidine kinase，HK)和調(diào)控靶基因表達(dá)的胞漿應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator protein，RRP)組成［1－4］。典型的HK含有一個(gè)長度約500個(gè)氨基酸的可變的N端感受域和一個(gè)長度約250個(gè)氨基酸的C末端傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域含有自體磷酸化的靶點(diǎn)即組氨酸的二聚體結(jié)構(gòu)域(H box)和包含N、G1、F和G2盒的ATP結(jié)合激酶結(jié)構(gòu)域。應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白R(shí)RP具有比較保守，長度大約為125個(gè)氨基酸的氨基端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有固定不變且可被磷酸化的Asp殘基。但還有一部分RRP除次之外尚含有C末端輸出結(jié)構(gòu)域，與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域相比，輸出結(jié)構(gòu)域的序列變化較大［5，6］。

1.2二元信號(hào)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)模式及功能二元信號(hào)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路由信號(hào)輸入、HK自身磷酸化、RRP磷酸化及信號(hào)輸出等環(huán)節(jié)構(gòu)成［3，4，7］。首先，跨膜的HK通過信號(hào)感受域敏銳地感受到外界環(huán)境的變化，并催化傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域上的His殘基發(fā)生ATP依賴的自體磷酸化。其次，磷酸基團(tuán)從高能磷酸化的His殘基轉(zhuǎn)移至RRP的Asp殘基。最后，磷酸化RRP與下游的目標(biāo)啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)或使目標(biāo)蛋白的功能發(fā)生適應(yīng)性變化。

通過信號(hào)傳導(dǎo)通路，TCSS能夠參與調(diào)節(jié)一系列生物應(yīng)激反應(yīng)［8］，包括滲透壓、光合作用、趨化現(xiàn)象、代謝物利用、生物發(fā)光、芽胞形成、細(xì)菌生長與成活、致病性以及抗生素耐藥性等多個(gè)方面。因此，全面系統(tǒng)地了解和掌握TCSS與細(xì)菌生長繁殖、毒力因子表達(dá)、耐藥性的關(guān)系，可以促進(jìn)我們對(duì)病原菌致病機(jī)理及細(xì)菌耐藥性形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為臨床診斷、治療和預(yù)防病原菌感染提供依據(jù)。

2　二元信號(hào)系統(tǒng)與細(xì)菌生長繁殖、毒力因子表達(dá)、耐藥性的關(guān)系

2.1二元信號(hào)系統(tǒng)與細(xì)菌生長繁殖病原菌的生長繁殖是其完成致病過程的最基本條件。在條件致病性枯草芽胞桿菌全基因組編碼的34個(gè)TCSS中，只有YycG/YycF對(duì)該菌的生長是必需的，可能是由于YycG/YycF能夠參與調(diào)控細(xì)胞的分裂過程［9］，在金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和肺炎鏈球菌中也發(fā)現(xiàn)了YycG/YycF，可能是由于YycG/YycF二元信號(hào)系統(tǒng)TCSS在維持細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性和通透性方面具有重要作用［10］。TCS02是肺炎鏈球菌中唯一與細(xì)菌生長存活密切相關(guān)的二元信號(hào)系統(tǒng)，近年的研究結(jié)果顯示，TCS02能夠參與細(xì)胞壁和脂肪酸的形成［11］。流感嗜血桿菌中的ArcB/ArcA和幽門螺桿菌中的HP1365/HP1364二元信號(hào)系統(tǒng)也都能夠參與調(diào)控細(xì)菌的生長［12］。

另外，幽門螺桿菌中的CheA/CheY二元信號(hào)系統(tǒng)能夠調(diào)控自身的趨化和定植，而CheA和CheY突變株雖有動(dòng)力，但不能定植于小鼠胃粘膜，無定植作用［13］。沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等革蘭氏陰性菌在致病過程中可通過PhoQ/PhoP TCSS誘導(dǎo)特異基因PagP的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)的改變，如對(duì)脂多糖(LPS)的脂質(zhì)A進(jìn)行特異修飾，從而增強(qiáng)細(xì)菌的抵御宿主抗微生物因子的滲透屏障［14，15］。

2.2二元信號(hào)系統(tǒng)與細(xì)菌毒力因子表達(dá)病原菌在感染宿主細(xì)胞的過程中，為了完成致病過程需要表達(dá)多種毒力因子。如金黃色葡萄球菌的致病機(jī)制與它所表達(dá)細(xì)胞外毒素、蛋白酶、胞壁黏附蛋白、a-毒素、δ-溶血素、脂酶和凝固酶等毒力因子有關(guān)。目前，在金黃色葡萄球菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有AgrC/AgrA、SaeR/SaeS、SrrA/SrrB、ArlR/ArlS等二元信號(hào)系統(tǒng)能夠上調(diào)與上述毒力因子相關(guān)的基因的表達(dá)［16，17］。而且，agr信號(hào)系統(tǒng)中AgrC/AgrA二元信號(hào)系統(tǒng)能夠調(diào)控糞腸球菌明膠酶(GelE)和絲氨酸蛋白酶(SprE)兩個(gè)重要致病物質(zhì)的產(chǎn)生［18］。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，CovS/CovR在調(diào)節(jié)表達(dá)化膿性鏈球菌溶血素S、鏈激酶、致熱外毒素B以及莢膜等致病物質(zhì)中具有非常重要的作用［19］。產(chǎn)氣莢膜梭菌的VirR/VirS［20］和弗氏志賀菌的EnvZ/OmpR分別能夠調(diào)控外毒素和內(nèi)毒素的產(chǎn)生。百日咳桿菌的BvgS/BvgA也能夠參與多種毒力因子表達(dá)的調(diào)控［21］。

2型豬鏈球菌是一種重要的人畜共患傳染病病原體，它的感染不僅可致豬患急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎甚至急性死亡，而且可通過傷口和呼吸道等途徑傳播，導(dǎo)致人的感染。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)二元信號(hào)系統(tǒng)SalK/SalR能夠調(diào)控高致病性2型豬鏈球菌的毒力，SalK/SalR的缺失能夠?qū)е略摼鷨适?duì)宿主動(dòng)物的致病性。

2.3二元信號(hào)系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥性除了直接調(diào)控上述信號(hào)表達(dá)外，有些TCSS還能夠介導(dǎo)甚至主導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗生素耐藥性。大腸桿菌是目前發(fā)現(xiàn)外排泵最多的一種細(xì)菌，如AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、OacE等主動(dòng)外排系統(tǒng)，其中AcrAB-TolC外排泵是其中最主要、占絕對(duì)優(yōu)勢的多藥外排系統(tǒng)，其過量表達(dá)可使大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、β-內(nèi)酰胺類抗生素、利福平和氟喹諾酮類等的耐受［23］。AcrAB的表達(dá)水平受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，如acrR、marA、mppA、sdiA，rob和soxS等，大腸桿菌EvgS/EvgA能夠正向調(diào)控AcrAB-TolC外排泵及emrKY、yhiUV和mdfA等藥物外排基因的表達(dá)，降低大腸桿菌對(duì)藥物的敏感性，從而導(dǎo)致大量的多藥耐藥菌株的出現(xiàn)［24］。SoxS也是一個(gè)正向調(diào)控因子，可激活包括編碼多重抗生素耐藥性操縱子的marAB、acrAB、tolC、micF和rimK基因等17個(gè)基因的表達(dá)，增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)一系列抗生素的耐受性，使其對(duì)多種藥物的耐藥性增強(qiáng)［25］。

Fan等［26］通過重組表達(dá)CiaH、CiaR、ComD、ComE 和ComC 5個(gè)基因產(chǎn)物，并分別制備其抗血清，發(fā)現(xiàn)CiaH和CiaR被抗血清封閉后，敏感菌株可出現(xiàn)對(duì)青霉素和頭孢胺噻的耐藥性，但對(duì)耐藥菌株耐藥性無明顯影響。ComD或ComC被抗血清封閉后，頭孢胺噻敏感菌株可出現(xiàn)耐藥性，但耐藥菌株耐藥性無明顯改變，也不影響各菌株對(duì)青霉素的耐藥性，說明肺炎鏈球菌的CiaH/CiaR和ComD/ComE與該菌對(duì)青霉素和頭孢胺噻的耐藥有關(guān)。另外，肺炎鏈球菌的VncS/VncR、糞腸球菌的VanS/VanR和耐萬古霉素腸球菌的VanS/VanR都能夠調(diào)控細(xì)菌的萬古霉素耐藥，而脆弱擬桿菌的RprX/RprR能夠調(diào)控細(xì)菌的四環(huán)素耐藥。結(jié)核分枝桿菌的SenX3/RegX3和PknH/EmbR分別是調(diào)控katG和embA/embB基因的TCSS，能夠調(diào)控其對(duì)異煙肼和乙胺丁醇的耐受性［27］。

3　二元信號(hào)系統(tǒng)抑制劑的研究進(jìn)展

目前已經(jīng)開發(fā)了許多種組氨酸激酶抑制劑，包括有反式脂肪酸類、異噻唑啉酮類、咪唑鎓鹽類、環(huán)己烯衍生物類、苯并噁嗪衍生物類、苯并咪唑衍生物類、雙酚甲酯類、水楊酰苯胺類、二芳基三唑類、鄰苯二?；犷?、漆樹酸衍生物類、環(huán)肽類、鏈霉素類、肽類等［28］。根據(jù)TCSS抑制劑作用靶位的不同，可以分為以下四類。

3.1組氨酸激酶信號(hào)識(shí)別抑制劑金黃色葡萄球菌agr系統(tǒng)中的AgrC/AgrA二元信號(hào)系統(tǒng)，可以調(diào)控編碼毒力因子基因和抗生素耐藥基因的表達(dá)，并且會(huì)調(diào)控產(chǎn)生一個(gè)被稱為AIP自誘肽的七到九肽的硫代內(nèi)酯，自誘肽可通過?；疉grC激酶信號(hào)感應(yīng)區(qū)的生物親和試劑，活化agr系統(tǒng)的循環(huán)。根據(jù)AIP-激酶的特異性，金黃色葡萄球菌菌株可以被分成四大類，每一個(gè)AIP可以活化自身的AgrC激酶，但是自身的AgrC激酶的抑制需要其它菌株AIP的作用。有關(guān)AIP信號(hào)肽結(jié)構(gòu)功能的研究發(fā)現(xiàn)，用不易于發(fā)生親核反應(yīng)的內(nèi)酯或內(nèi)酰胺代替AIP結(jié)構(gòu)中的硫代內(nèi)酯，會(huì)形成一些不能活化自身但可以抑制其它菌株agr系統(tǒng)的抑制劑［16，29］。

3.2組氨酸激酶自體磷酸化抑制劑組氨酸激酶抑制劑對(duì)自體磷酸化的抑制有多種機(jī)制［28］，包括抑制激酶的二聚體作用;抑制激酶反應(yīng)的H-box或催化區(qū);或者與ATP競爭性結(jié)合ATP結(jié)合區(qū)。第一個(gè)被文獻(xiàn)報(bào)道的自體磷酸化抑制劑是從蛋黃里面提取的L-a-溶血性磷脂酰膽堿，它能夠抑制枯草芽孢桿菌中組氨酸激酶KinA的活性。

另外，有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸轉(zhuǎn)移酶四螺旋束很可能是組氨酸激酶在自體磷酸化結(jié)構(gòu)域部位形成二聚體的主要位點(diǎn)。Stephenson等［30］在體外實(shí)驗(yàn)中觀察到氯氰碘柳胺和RWJ-49815這兩種藥物能夠選擇性抑制枯草芽孢桿菌KinA激酶的自體磷酸化作用，它們很可能是通過插入到磷酸轉(zhuǎn)移酶四螺旋束的核心，暴露出其疏水表面，從而阻止二聚體的形成。

Matsushita等［31］研究發(fā)現(xiàn)1-芐基-3-十四烷基-2-甲基咪唑-1-溴化物是一種通用的二組分系統(tǒng)抑制劑，能夠強(qiáng)烈的抑制可溶性組氨酸激酶CheA、NRII和KinA的活性，同時(shí)也能夠抑制具有磷酸化活性的跨膜蛋白激酶VirA。另外，從鏈霉菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的鹵代吡咯苯并噁嗪類物質(zhì)，能夠抑制NRII的自體磷酸化，并且對(duì)細(xì)菌和真菌有一定的殺傷作用［32］。

咪唑鎓鹽及其類似物在大約100 μmol/L時(shí)能夠抑制組氨酸激酶CheA、NRII和KinA的活性。最近，一系列結(jié)構(gòu)類似于咪唑鎓鹽的化合物被證實(shí)有抑制組氨酸激酶EnvZ、PhoQ、BvgS和EvgS等的活性［33］，其中有一種物質(zhì)分別在0.78、0.39和3.12 μg/ml時(shí)能夠顯著抑制耐苯唑西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌及肺炎鏈球菌的生長。

3.3應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白磷酸化抑制劑目前，已經(jīng)證實(shí)芳基硫代吡咯烷酮能夠抑制磷酸基團(tuán)從組氨酸激酶到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)移［34］。通過重組表達(dá)VanS和VanR蛋白，模擬VanS/VanR二元信號(hào)系統(tǒng)的體外環(huán)境，發(fā)現(xiàn)芳基硫代吡咯烷酮是可以抑制VanR的接收活性而不是磷酸化的VanS的供給活性，并且只有在高濃度時(shí)(半數(shù)有效量為0.35 mM)才可以起到抑制作用。

3.4應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白與啟動(dòng)子相互作用抑制劑Matsushita等［31］通過凝膠遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1-芐基-3-十四烷基-2-甲基咪唑-1-溴化物在大約150 μmol/L時(shí)能夠抑制AlgR1與algD啟動(dòng)子的結(jié)合，并且它是能夠抑制algD啟動(dòng)子的特異性抑制劑，它不同于抑制DNA-蛋白質(zhì)相互結(jié)合的非特異性的抑制劑，主要是因?yàn)樗狈atR結(jié)合到catBC啟動(dòng)子上的活性。

4　問題與展望

目前為止，國內(nèi)外針對(duì)TCSS進(jìn)行的藥物開發(fā)研究還處于起步階段，雖然已經(jīng)建立了許多個(gè)藥物化學(xué)庫來篩選TCSS抑制劑，但大多數(shù)抑制劑都是針對(duì)組氨酸激酶的，特異性不強(qiáng)，可能會(huì)對(duì)人類造成損傷，而且，目前大多數(shù)化合物都存在溶解性低或是疏水性的問題，這其中最大的原因可能是由于這些藥物的藥效基團(tuán)不合適，或者，這些化合物是在篩選的過程中被錯(cuò)誤判斷的。在基于底物設(shè)計(jì)的TCSS抑制劑的經(jīng)典方法中，穩(wěn)定的磷酸化組氨酸模型化合物需要被整合成小肽，但同源組氨酸的合成已經(jīng)成為固相合成這些肽類的最大障礙［35］。

鑒于藥物化學(xué)庫里缺乏TCSS抑制劑的備選藥物，一些專家和學(xué)者開始采用新的策略來篩選和鑒定TCSS抑制劑。目前，已經(jīng)證實(shí)通過使用X射線或核磁共振NMR法并且結(jié)合著計(jì)算機(jī)技術(shù)來研究HK胞內(nèi)區(qū)的方法［36］，可以用來從化合物庫中篩選先導(dǎo)化合物，并且，這種方法還可以解決藥物的疏水性問題。新型CheA激酶的N-乙?；?、C-酰胺化的、D-型氨基酸的六肽抑制劑是通過反復(fù)篩選和單位點(diǎn)掃描矩陣相結(jié)合的方法被發(fā)現(xiàn)，它在8 μmol/L時(shí)能夠抑制CheA激酶73%的自體磷酸化，并且有一定的抗革蘭陰性病原菌的活性［37］。同時(shí)，通過類比于酪氨酸激酶抑制劑的開發(fā)，對(duì)TCSS中的組氨酸激酶進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)方法的建立也是很有必要的。

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(收稿日期:2014－12－09)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.041

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 08－1229－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 378