李曉燕　趙杰　趙麗雅　郝雪濤　許娜娜

黏液性銅綠假單胞菌的耐藥性分析

李曉燕趙杰趙麗雅郝雪濤許娜娜

【摘要】目的分析銅綠假單胞菌(PAE)對抗菌藥物的耐藥情況，為臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。方法應(yīng)用K-B法分別測試110株黏液型和110株非黏液型銅綠假單胞菌對常用的13種抗菌藥物的敏感性，并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果黏液型銅綠假單胞菌對美洛培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素的敏感率明顯高于黏液型銅綠假單胞菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，對亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、環(huán)丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論黏液型PA體外藥敏試驗?zāi)退幮暂^低，但體內(nèi)用藥治療效果不佳，而使用體外藥敏試驗敏感藥物與能抑制細(xì)菌表面生物膜作用的藥物聯(lián)合使用，治療效果較為明顯。

【關(guān)鍵詞】黏液型銅綠假單胞菌;耐藥性;生物膜;抗菌藥物

作者單位: 056001河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科

近年來，銅綠假單胞菌(PAE)感染增多，且治療十分棘手，常出現(xiàn)藥敏試驗結(jié)果與臨床治療不一致的現(xiàn)象，其原因之一是生物膜的形成。銅綠假單胞菌根據(jù)菌落形態(tài)及是否產(chǎn)生大量藻酸鹽，可將PAE黏液型和非黏液型2個型別［1］。黏液型PAE極易吸附于導(dǎo)管、黏膜表面形成生物膜，引起臨床難治性感染［2］?，F(xiàn)對我院分離的110株黏液型PAE和110株非黏液型PAE進行藥敏分析，并進一步探討大環(huán)內(nèi)酯類與喹諾酮類藥物聯(lián)合運用對黏液型PAE的治療效果，為臨床提供更可靠有利的藥敏結(jié)果。

1　材料與方法

1.1實驗材料選取2011年6月至2013年5月河北省邯鄲市中心醫(yī)院住院患者的痰標(biāo)本，從標(biāo)本中共分離的黏液型和非黏液型PAE各110株，同一患者多次分離到的菌株不重復(fù)計入。

1.2試劑所有菌株經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)后，用梅里艾廠家提供的Vitec2及配套GN鑒定板進行菌株鑒定。血平板及中國蘭平板由天津金章公司提供，藥敏紙片購自英國Oxoid公司，藥敏紙片包括亞胺培南、美洛培南、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、慶大霉素、氨曲南。

1.3菌株分離與鑒定標(biāo)本培養(yǎng)、分離嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作程序》第3版進行。

1.3.1黏液性PAE的菌落形態(tài):經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h，粘液性銅綠在血板上生長為無色、小露滴樣、邊

緣不規(guī)則、不溶血小菌落、48 h長大而融合、粘稠、膠凍樣菌落、溶血不典型、可有可無。用接種環(huán)挑起無金屬光澤、無特殊氣味的菌落，分純后經(jīng)過法國梅里艾VITEK2Compact鑒定為PAE，判定為黏液型PAE。

1.3.2非黏液型PAE的菌落形態(tài):經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h，黏液型銅綠在血板上生長為大而扁平、濕潤、有金屬光澤、藍綠色、透明溶血環(huán)的菌落、有生姜味。分純后經(jīng)過法國梅里艾VITEK2Compact鑒定為銅綠假單胞菌，判定為非黏液型PAE。

1.4藥敏試驗與結(jié)果判讀用標(biāo)準(zhǔn)濃度紙片法(Kirby-Bauer)法對13種常用抗生素做敏感性試驗。使用銅綠假單胞菌ATCC27853進行質(zhì)控。非黏液型銅綠假單胞菌采用24 h的結(jié)果判讀。因為黏液型銅綠假單胞菌生長緩慢，常規(guī)24 h在MH板上判讀會造成假陰性，所以采用培養(yǎng)48 h的結(jié)果，或是血MH板24 h判讀(因為該菌在血MH上生長良好)，判讀按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會2011年的標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌耐藥性分析中介納入敏感合計為敏感株，黏液型PAE對美洛培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素的敏感率高于非黏液型PAE，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，對亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、環(huán)丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2黏液型PAE的治療效果110株黏液型PAE隨機分為2組。其中一組單用表1藥敏結(jié)果(左氧沙星)進行抗菌藥物治療(對照組)，另一組用左氧沙星與

表1　黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌對13種抗菌藥物敏感性比較　種(%)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用治療(試驗組)，這2組都治療2周后復(fù)檢，再次復(fù)檢沒有培養(yǎng)出黏液型PAE的為治療有效，培養(yǎng)出黏液型PAE的為治療無效。2組治療黏液型PAE有效率不等，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=42.9，P＜0.05)。見表2。

表2　2組治療黏液型PAE有效率的比較

3　討論

PAE是假單胞菌屬中最為常見的致病菌之一，近年來，PAE在醫(yī)院的分離率一直居高不下，且耐藥性強、難以根除，已成為臨床治療的難點［3］。

其耐藥的原因主要有以下幾個方面: (1)產(chǎn)生多種滅活酶或鈍化酶，如Ampe酶、超廣譜B一內(nèi)酰胺酶和金屬酶; (2)基因的突變，如DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶及DNA回旋酶突變，膜的通透性下降，主動外排泵系統(tǒng)的過量表達; (3)生物被膜，細(xì)菌生物被膜(biofilm)在PAE感染中廣泛存在，是導(dǎo)致抗菌治療失敗的重要原因之一; (4) DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)，PAE的耐藥機制極為復(fù)雜，它對某一類抗菌藥物的耐藥常是幾種機制協(xié)同作用;它對不同抗菌藥物的耐藥機制也不完全相同，而且還不斷有新的耐藥機制出現(xiàn)［4］。

從附表1可以看出，黏液型PAE的體外敏感抗生素較多，耐藥性較弱，且弱于非黏液型PAE的耐藥性。這表明在不考慮，黏液型PAE形成生物膜的情況下，選用抗生素的范圍要比非，黏液型PAE廣得多。黏液型PAE是PAE在自然界中存在的一種特殊形式，非黏液型PAE在一定的條件下可轉(zhuǎn)化成黏液型PAE，其表面存在大量以多糖藻酸鹽為主要成分的粘液，從而可形成生物膜［5，6］。藻酸鹽是黏液型銅綠假單胞菌形成生物被膜的主要成分，可以使其能夠免于被藥物清除，造成其長期定值［7］，造成慢性、反復(fù)性感染，同時也會造成藥敏試驗結(jié)果與臨床治療效果不相符合，給用藥帶來困難。體外研究發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽在，黏液型PAE生物被膜的形成中發(fā)揮著重要的作用，所以除去生物被膜必須設(shè)法減少藻酸鹽的合成。

從表2我們可以明顯的看出聯(lián)合用藥的治療效果明顯優(yōu)于單一用藥。按藥敏結(jié)果來看，左氧可以用于治療黏液型PAE的經(jīng)驗治療藥物，可是從表2中看出左氧治療黏液型PAE的效果相當(dāng)?shù)牟缓茫斡蕛H為14.55%(8/55)。所以在治療黏液型PAE時必須考慮其生物被膜的影響。而第二組用左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用大大提高了其殺菌效果，55例患者經(jīng)聯(lián)合用藥治療2周后，有44例均有不同程度的好轉(zhuǎn)，其微生物檢查結(jié)果:未檢出黏液型PAE。其治愈率為80.00%(44/55)。

PAE生物膜的主要成分是胞外黏多糖，而黏多糖的主要成分是藻酸鹽。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過抑制藻酸鹽生物合成途徑中的二磷酸甘露糖脫氫酶(GMD)活性［8］，減少藻酸鹽合成，從而破壞黏液型PAE表面的生物膜，降低細(xì)菌的黏附性，使敏感藥物的治療效果明顯增強。有研究表明，部分大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物如阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素等能有效減低生物被膜的抵抗作用，與體外敏感藥物聯(lián)合運用，能使敏感藥物容易穿過被膜屏障接觸到菌體，提高殺菌效果［9－11］，延長患者的生命。筆者在左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類藥物體外聯(lián)合藥敏試驗中得出，兩藥聯(lián)用后的抗菌活性有很大程度地提高。

雖然左氧沙星與大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)聯(lián)用于PAE等細(xì)菌生物被膜可以起到一定的增效作用，但尚未完全殺滅被膜下細(xì)菌。

黏液型PAE被膜的產(chǎn)生有多方面的原因，大量抗菌藥物的應(yīng)用及內(nèi)置管道等都易誘發(fā)生物膜的產(chǎn)生，臨床應(yīng)加強加大抗菌藥物的監(jiān)管和應(yīng)用，減少黏液型PAE引起的院內(nèi)感染，監(jiān)測抗菌藥物對黏液型PAE的耐藥性變化，及時為臨床提供抗菌藥物的耐藥性變化，指導(dǎo)臨床用藥。臨床醫(yī)師在治療黏液型PAE引起的感染時，應(yīng)根據(jù)病原菌特點結(jié)合藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。另外，在抗菌藥物治療過程中，銅綠假單胞菌治療3～4 d后即可能發(fā)生耐藥，所以患者在治療過程中，應(yīng)隨時監(jiān)測抗生素的敏感性變化，調(diào)整治療方案，提高治療效果。

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(收稿日期:2014－10－23)

通訊作者:趙杰，056001河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科; E-mail: zjlxy1208@ sina.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.048

【文章編號】1002－7386(2015) 08－1247－03

【文獻標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 378.991