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骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞定向分化的研究進展

何芒李寧夏磊

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科河南 鄭州450052)

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞；培養(yǎng)分離方法；誘導(dǎo)分化方法；三維培養(yǎng)微環(huán)境

人體關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力有限，目前關(guān)節(jié)軟骨損傷后的臨床治療效果仍不夠理想。軟骨組織工程的提出為軟骨損傷修復(fù)提供了新的選擇，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是成體干細胞中的一種，其來源充足，具有可再生能力和多向分化能力，也基本不存在免疫排斥和倫理學(xué)上的限制，是軟骨組織工程的一種理想種子細胞。BMSCs向軟骨定向誘導(dǎo)分化是一個復(fù)雜的過程，需要合適的培養(yǎng)分離方法、誘導(dǎo)分化方法、三維培養(yǎng)微環(huán)境，以及相關(guān)物理因素的刺激。這些因素一直是軟骨組織工程研究的難點和熱點，因此，本文對這些方面最近的研究進行總結(jié)。

1BMSCs的培養(yǎng)分離方法

BMSCs在骨髓中含量較低且體外培養(yǎng)難度大，通過體外分離培養(yǎng)得到純度高、活性強且生物特性均一的BMSCs對軟骨組織工程及其臨床應(yīng)用顯得至關(guān)重要。

1.1全骨髓貼壁培養(yǎng)法利用造血細胞不貼壁而BMSCs貼壁的特點進行分離，隨著換液和傳代，在第3代能獲得形態(tài)均一、高表達CD29、Scal-1且?guī)缀醪槐磉_CD45的BMSCs細胞群[1]。實驗通過全骨髓貼壁法培養(yǎng)兔BMSCs，通過換傳代得到了純度較高且具有活性的兔BMSCs[2]，王曉慶等[3]利用改良六孔板法培養(yǎng)出了大量貼壁活性的BMSCs，且比傳統(tǒng)方法更便捷、高效。

1.2流式細胞儀免疫磁珠分離法Houlihan等[4]利用別藻藍蛋白接合血小板源性生長因子受體-α抗體，異硫氰酸熒光素接合Sca-1抗體，藻紅蛋白接合CD45抗體和Ter-119抗體與骨髓細胞過濾懸液培養(yǎng)后，經(jīng)流式細胞儀去除死細胞和CD45+Ter-119+細胞系，得到了純度較高、生物特性穩(wěn)定的BMSCs。但此方法對實驗室要求很高，且對細胞損傷大。另外，由于BMSCs在骨髓中的含量很低，每1×104～1×105個單核細胞中約有1個BMSC，每次分選均需要大量的小鼠骨髓。

1.3紅細胞溶解法Peterbauer-Scherb等[5]通過比較3種分離小型豬BMSCs的方法(紅細胞溶解法、右旋糖苷沉降法和密度梯度離心法)發(fā)現(xiàn)，紅細胞溶解法是短時間內(nèi)分離BMSCs最高效的方法，此方法可獲得最高的細胞產(chǎn)率，為獲得更純化的BMSCs提供了新思路。

2誘導(dǎo)分化方法

目前骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)的方法較多，比較常見的誘導(dǎo)分化方法有兩種，一種是生物化學(xué)誘導(dǎo)法，另一種是共培養(yǎng)法。

2.1生物化學(xué)誘導(dǎo)法生物化學(xué)誘導(dǎo)法主要是通過干預(yù)定向分化過程中的各種生物化學(xué)因子進行定向誘導(dǎo)分化。

2.1.1SOX家族研究發(fā)現(xiàn)，SOX9上游編碼區(qū)包括多個成軟骨分化增強子，其發(fā)生染色體畸變可導(dǎo)致短指發(fā)育不良等軟骨發(fā)育障礙疾病[6]。Zhou等[7]通過抑制敲入纖維母細胞生長因子受體3基因的突變體細胞內(nèi)SOX9的表達，從而加速了肥大前軟骨細胞軟骨內(nèi)成骨的過程，提示SOX9是一個局限性區(qū)域高度流動性的轉(zhuǎn)錄因子，是BMSCs向軟骨細胞定向分化的一個關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子。

2.1.2miR29-bmiR29-b在BMSCs向軟骨細胞的分化中具有正性調(diào)節(jié)作用[8]，可對同在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用的HDAC4進行調(diào)節(jié)[9]。HDAC4與Runx2結(jié)合后抑制Runx2和DNA的結(jié)合，從而正性調(diào)節(jié)軟骨細胞肥大分化，但研究發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)生成的軟骨細胞表現(xiàn)出肥大化表型后，會影響軟骨細胞功能的穩(wěn)定性，而發(fā)生細胞凋亡和基質(zhì)鈣化等現(xiàn)象，應(yīng)用anti-miR-29b inhibitor使miR-29b受抑制后，可抑制軟骨細胞肥大化過程，進而達到穩(wěn)定細胞表型的目的[10]。

2.1.3TGF-βTGF-β是誘導(dǎo)BMSCs軟骨分化的重要因子之一，劉印等[11]發(fā)現(xiàn)TGF-β1能全程誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化。TGF-β1誘導(dǎo)了BMSCs ColⅡ和ColⅩ基因的表達，而bFGF和PTHrP 抑制BMSCs在軟骨分化過程中ColⅡ和ColⅩ基因表達，這兩個細胞因子削弱了TGF-β1對BMSCs軟骨誘導(dǎo)分化的作用，并抑制軟骨化進程。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合表達BMP2和SOX9能促進體外MSCs成軟骨分化[12]。

2.1.4PTHrP和IhhPTHrP是激素前體，絕大多數(shù)細胞能分泌PTHrP，細胞表面也存在1個或多個介導(dǎo)細胞旁分泌、自分泌、內(nèi)分泌的PTHrP受體，其在軟骨的形成發(fā)育過程中有相當(dāng)重要的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位導(dǎo)致髁突軟骨結(jié)構(gòu)進行性病理性損害，Ihh和PTHrP在盤移位后髁突軟骨病理性改變的過程中發(fā)揮重要作用，提示關(guān)節(jié)盤前移位可能通過Ihh-PTHrP負反饋信號通路對生長期髁突軟骨內(nèi)成骨過程產(chǎn)生影響[13]。Fischer等[14]研究顯示，關(guān)節(jié)軟骨細胞分泌的PTHrP能抑制共培養(yǎng)的BMSCs向肥大軟骨細胞分化。

Ma等[15]發(fā)現(xiàn)Ihh是調(diào)節(jié)雞軟骨細胞增殖和肥大平衡的重要信號分子，并且調(diào)控Ihh依賴通路上PYHrP的功能，另外，BMP-6和Bcl-2阻礙Ihh信號通路的下游調(diào)節(jié)因子在維持軟骨細胞增殖上發(fā)揮重要作用。

2.1.5FGF實驗結(jié)果顯示，在軟骨細胞中硫酸酯酶在增強BMP的同時抑制FGF信號途徑，從而保持穩(wěn)定的軟骨細胞內(nèi)環(huán)境[16]。人類和鼠類高度保守性的FGFR3是酪氨酸激酶受體之一，在不同組織中可以表達，包括軟骨組織，而敲除FGFR3等位基因的小鼠，其生存壽命變短，骨骼過度肥大[17]。

2.1.6IGFIGF在正常軟骨中起維持軟骨細胞代謝穩(wěn)態(tài)的作用，保持著體外蛋白多糖合成和分解的平衡，是TGF-β1的重要輔助因子。研究顯示，當(dāng)歸蟲草多糖刺激IGF1和IGF1R基因過表達后，可以使黏多糖和尿苷二磷酸糖的生成增多，從而促進軟骨低聚基質(zhì)蛋白的表達，通過分泌軟骨低聚基質(zhì)蛋白連接骨基質(zhì)中的纖維而促進軟骨修復(fù)，這為關(guān)節(jié)軟骨的治療提供了一定的臨床價值[18]。Pasold等[19]實驗證實，在加入硅納米顆粒接合IGF的膠原骨架培養(yǎng)基中培養(yǎng)軟骨細胞能明顯減少Ⅰ型膠原含量，增加Ⅱ型膠原的含量，提示其在靶向和可控治療軟骨損傷方面具有一定臨床意義。Yang等[20]發(fā)現(xiàn)TGF-β1可能通過抑制Smad3磷酸化從而抑制纖維囊的形成，使生長的軟骨細胞結(jié)構(gòu)更加均勻，另外在流體力學(xué)的刺激下TGF-β1能夠互反地對Smad2和Smad3通路進行調(diào)控，經(jīng)過短暫的TGF-β1暴露可以促進軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，為軟骨的修復(fù)打下基礎(chǔ)。

2.1.7雌激素雌激素受體存在于軟骨細胞表面。軟骨細胞表面的雌激素受體主要分為α和β 2種，其中α受體主要分布在人類關(guān)節(jié)和生長板軟骨中，β受體則主要位于生長板中的肥大細胞中。雌激素通過軟骨細胞表面的雌激素受體起作用，與軟骨正常代謝與修復(fù)有密切的關(guān)系。一項體外牛軟骨移植研究顯示[21]，雌激素影響TGF-β2、TGF-β3和軟骨細胞的標(biāo)志基因之一Ⅱ型膠原α1的表達，進而影響軟骨細胞的分化與形成。

2.1.8炎性因子炎性因子對BMSCs向軟骨細胞定向分化也有重要的影響，與關(guān)節(jié)軟骨的功能抑制作用密切相關(guān)。其中，白介素-1和腫瘤壞死因子的影響最為重要，白介素-1可促進一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶-2的表達，抑制軟骨細胞表達蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，并促進細胞分解代謝[22]。Murray等[23]指出，人軟骨細胞的異常形態(tài)學(xué)與白介素-1β的水平增高和細胞外Ⅳ型膠原的斷裂有關(guān)。

2.2共培養(yǎng)誘導(dǎo)法共培養(yǎng)誘導(dǎo)法指在體外模擬體內(nèi)BMSCs與軟骨細胞相互作用的內(nèi)環(huán)境，達到使BMSCs增殖和定向分化的目的。

2.2.1直接接觸共培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)將無標(biāo)記的軟骨細胞與熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細胞以1∶2的比例混合均勻，進行共培養(yǎng)后應(yīng)用熒光標(biāo)記結(jié)合流式細胞術(shù)和共聚焦技術(shù)對直接接觸共培養(yǎng)體系中的細胞分析后發(fā)現(xiàn)在直接接觸共培養(yǎng)體系中骨髓間充質(zhì)干細胞有明顯的成軟骨分化現(xiàn)象，但其比例逐漸減少，7 d后體系中軟骨細胞成為主導(dǎo)細胞類型[24]。

2.2.2Transwell共培養(yǎng)法Transwell共培養(yǎng)是運用一種特殊的共培養(yǎng)工具進行細胞共培養(yǎng)，其共培養(yǎng)的兩部分之間有一聚碳酸酯通透膜，這層膜帶有微孔，孔徑大小為0.1～12.0 μm，從而實現(xiàn)非接觸性共培養(yǎng)。王萬宗等[25]發(fā)現(xiàn)將BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨細胞在膜孔徑為0.4 μm的Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中共培養(yǎng)誘導(dǎo)20 d，經(jīng)共培養(yǎng)誘導(dǎo)后檢查發(fā)現(xiàn)，BMSCs被誘導(dǎo)成軟骨樣細胞。

2.2.3微囊體系培養(yǎng)法微囊是利用天然的或者合成的材料經(jīng)過靜電黏附、沉淀等工藝合成的一類囊狀物，目前應(yīng)用最為成熟的微囊是海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊，張瑾等[26]利用APA微囊發(fā)生器制得微囊化軟骨細胞，并將其接種于培養(yǎng)BMSCs 12 h后的Transwell小室中進行共培養(yǎng)，在不影響B(tài)MSCs純度和增殖的情況下成功誘導(dǎo)BMSCs向成軟骨方向定向分化，且誘導(dǎo)效果優(yōu)于傳統(tǒng)的Transwell膜分離共培養(yǎng)法。

3三維培養(yǎng)微環(huán)境

三維培養(yǎng)環(huán)境是軟骨組織工程中至關(guān)重要的一部分，它可以有效地促進干細胞的增殖和分化，同時也能夠在新的組織形成前承載機械應(yīng)力，在軟骨組織工程中理想的三維培養(yǎng)支架應(yīng)該具有良好的生物相容性、一定機械柔韌度、多孔可滲透而且可在體內(nèi)生物降解，雖然合成材料在控制機械應(yīng)力、形態(tài)學(xué)及物理化學(xué)因素方面具有一定優(yōu)勢，但這些材料常常引起體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，近年來廣泛使用的是一些非合成材料，如絲心蛋白、膠原、明膠、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等。

3.1Ⅱ型膠原支架有研究表明以Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)為細胞外支架材料與干細胞聯(lián)合移植可促進其向軟骨細胞方向分化[27]，由軟骨細胞分泌合成的CollagenⅡ為軟骨細胞的生存提供了良好的條件，有實驗證實100 μg/ml的CollagenⅡ通過與之相關(guān)的受體正反饋調(diào)控了SOX9蛋白的表達，引起一系列誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，促進BMSCs向軟骨細胞的分化[28]。

3.2三維SF-GCH支架Sawatjui等[29]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過冷凍干燥法制備的三維絲心蛋白/明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸(SF-GCH)支架能夠有效地促進BMSCs的自身增殖并且促進其向軟骨細胞定向分化，此種支架中的GCH可以通過與生長因子相互作用而提供與增值分化有關(guān)的信號分子，從而促進MSCs的增值分化，顯示SF-GCH混合支架可以作為軟骨組織工程中促進和維持MSCs定向分化的一種新的生物材料。

4相關(guān)物理因素刺激

4.1基底材料表面粗糙度基底材料表面的粗糙度是影響細胞行為的重要因素，通過調(diào)節(jié)材料表面的粗糙度，可以調(diào)控細胞在材料表面的生長行為[30-31]。有研究發(fā)現(xiàn)以柞蠶絲膠(AS)溶液為模板，誘導(dǎo)羥基磷灰石(HAp)晶體的生成，可達到調(diào)控AS 膜表面粗糙度的目的，具有一定粗糙表面的HAp/AS 復(fù)合膜有利于BMSCs的黏附和增殖，且具有良好的生物相容性，粗糙度為1.2 μm的HAp/AS復(fù)合膜能顯著促進BMSCs的增殖，并促進其在初期培養(yǎng)時的黏附，為BMSCs的貼壁培養(yǎng)提供了一種新的實驗依據(jù)[32]。

4.2機械應(yīng)力刺激黃艷等[33]指出機械刺激，如勞損、切應(yīng)力、壓應(yīng)力、重力等對BMSCs的增殖、細胞骨架與分化均有影響，周圍環(huán)境的機械刺激能通過各種信號途徑調(diào)節(jié)BMSCs的生物學(xué)行為，這方面的研究將促進BMSCs向軟骨分化的全面理解和有效利用。文獻報道通過利用原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對體外培養(yǎng)的大鼠MSCs細胞骨架進行高分辨成像，同時使用帶有微球的微懸臂實施微區(qū)力曲線檢測后發(fā)現(xiàn)細胞的彈性模量隨應(yīng)力刺激時間增長而增大，為通過控制應(yīng)力刺激時間調(diào)節(jié)BMSCs分化的可能性提供了依據(jù)[34]。

5展望

目前應(yīng)用BMSCs軟骨誘導(dǎo)分化修復(fù)軟骨缺損的方法已取得一定進展，但調(diào)控BMSCs向軟骨細胞定向分化的各種因素是極其復(fù)雜的，在此過程中，促進定向分化因素與抑制定向分化因素保持著動態(tài)平衡，了解這一動態(tài)平衡的變化規(guī)律，并明確其機制，才能獲得一種理想的培養(yǎng)BMSCs向軟骨定向分化的方法。這將為軟骨細胞工程與組織工程的研究提供指導(dǎo)性的意義，同時，也為臨床上治療軟骨損傷提供更多的依據(jù)與保障。因此，研究BMSCs向軟骨細胞的定向分化并將其更好地應(yīng)用于臨床，是當(dāng)今應(yīng)對軟骨損傷的一大趨勢，也是軟骨組織工程未來研究發(fā)展的方向。

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收稿日期：(2015-07-20)

【中圖分類號】R 394.2doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2015.12.029

通訊作者：夏磊，E-mail：2826292062@qq.com。