劉曉梅 張芳 黃建敏

·綜述·

腫瘤血管生成的SPECT分子顯像研究進(jìn)展

劉曉梅 張芳 黃建敏

腫瘤血管生成與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。腫瘤血管生成被各種蛋白分子調(diào)控，其中包括血管內(nèi)皮生長因子、αvβ3整合素、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、前列腺特異性膜抗原等。它們已成為腫瘤血管生成分子影像及靶向治療研究領(lǐng)域的重要分子靶點。研究并利用這些蛋白分子準(zhǔn)確無創(chuàng)地評估腫瘤新生血管及腫瘤抗血管生成治療效果的成像方法，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)的一個重要課題。

血管生成；血管內(nèi)皮生長因子；αvβ3整合素；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；前列腺特異性膜抗原；體層攝影術(shù)，發(fā)射型計算機，單光子

腫瘤血管生成在實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等生物行為過程中起關(guān)鍵作用，而針對腫瘤新生血管的成像，對病變檢測、腫瘤分級、預(yù)后判斷、腫瘤藥物的研發(fā)及有效性評價、用藥劑量的個性化指導(dǎo)、療效的監(jiān)測等都有著重要的指導(dǎo)意義[1]。

當(dāng)實體腫瘤直徑＞2～3mm時，僅靠單純的養(yǎng)分?jǐn)U散已不再能滿足組織養(yǎng)分的供給，缺氧即可誘發(fā)腫瘤血管生成，其過程是復(fù)雜多步驟的，且被生長因子、細(xì)胞受體、黏附分子等調(diào)節(jié)和控制[2-4]，如血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF）、αvβ3整合素受體、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）蛋白、前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）等[5-6]。這些因子在實體腫瘤中高表達(dá)，將它們作為核醫(yī)學(xué)分子顯像的顯像劑有著很好的應(yīng)用前景。因此，本文將對腫瘤血管生成的SPECT分子顯像的顯像劑研究進(jìn)行回顧性總結(jié)。

1 VEGF受體（vascular endothelial grow th factor receptor，VEGFR）SPECT顯像

VEGF是一組由VEGF-A、VEGF-F及胎盤生長因子組成的家族，其中VEGF-A具有激活受體VEGFR-1和VEGFR-2的功能，在血管生成中起主要作用。VEGF-A基因可產(chǎn)生4個亞型：VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189和VEGF-206[7]。

VEGFR主要有5種亞型，其中VEGFR-1與VEGFR-2是最重要的2個亞型， VEGFR-1與VEGFR-2相比，VEGFR-1與VEGF有很高的親和力，但VEGFR-1被認(rèn)為是個誘騙受體，其絡(luò)氨酸激酶活性相對較低，VEGF-A唯一的信號是經(jīng)過VEGFR-2傳遞的，表明VEGFR-2是促進(jìn)血管生成的主要受體[8-9]。

VEGF的兩個亞型VEGF-121和VEGF-165作為VEGFR SPECT顯像的分子靶點的潛質(zhì)被廣泛研究。Yoshimoto等[10]將125I-VEGF-121和125I-VEGF-165作為顯像劑在LS180腫瘤裸鼠中的分布進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，125I-VEGF-165與125I-VEGF-121在腫瘤部位均有較高的攝取，并隨著腫瘤體積增大濃聚增多。125I-VEGF-121腫瘤攝取和T/NT值要高于125I-VEGF-165。此項研究證實了125I-VEGF-121與125I-VEGF-165在腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶中有聚集，但同時在甲狀腺及胃中也有較高的攝取，表明該類顯像劑在體內(nèi)不穩(wěn)定，易脫碘。

除應(yīng)用放射性核素碘標(biāo)記VEGF亞型外，99Tcm和111In標(biāo)記VEGF亞型也已被研究。Blankenberg等[11]先用99Tcm標(biāo)記一種銜接蛋白，然后再與對接目標(biāo)融合形成目標(biāo)蛋白的方法進(jìn)行標(biāo)記。如利用人核糖核酸激酶I的109氨基酸（HuS）與15氨基酸（Hu-tag）片段的相互作用，充當(dāng)銜接蛋白的作用，用放射性核素99Tcm標(biāo)記，然后再與目標(biāo)蛋白VEGF連接，即合成99Tcm-HuS/Hu-VEGF，將其作為顯像劑用于小鼠腫瘤血管生成顯像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌4T1-luc腫瘤裸鼠上可見數(shù)毫米大小腫瘤組織顯影。在同樣的腫瘤模型中，利用肼基煙酰胺（hydrazine nicotinamide，HYNIC） 螯合的99Tcm-HYNIC-VEGF與99Tcm-HuS/Hu-VEGF具有相同的生物學(xué)分布，99Tcm-HYNIC-VEGF用于SPECT顯像，在腫瘤區(qū)域顯示出比較高的不均勻放射性濃聚。Blankenberg等[12]將對照組用99Tcm標(biāo)記生物滅活的VEGF，與99Tcm-HYNIC-VEGF對比顯示，腫瘤部位放射性濃聚減少75%，表明生物滅活的VEGF不與受體結(jié)合，從而證實了99Tcm-HYNIC-VEGF在腫瘤部位濃聚是因特異性地與VEGFR結(jié)合所致。

除了對VEGF本身進(jìn)行標(biāo)記，還可從基因水平改進(jìn)VEGF及其受體的結(jié)構(gòu)后進(jìn)行標(biāo)記。Chan等[13]利用VEGF-165融合一個多肽GGGGS3，多肽再連接到人轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基端小葉，即合成重組蛋白VEGF后再用111In進(jìn)行標(biāo)記，得到111In-hnTf-VEGF。將其作為顯像劑進(jìn)行SPECT顯像，結(jié)果顯示，其可濃聚在人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤荷瘤裸鼠的腫瘤種植部位（6.7%ID/g,注射后72 h）。對照組的荷瘤裸鼠先注射100倍過量VEGF，使其與腫瘤部位VEGFR競爭結(jié)合后，再注射顯像劑111In-hnTf-VEGF，其腫瘤種植部位攝取111In-hnTf-VEGF量減少15倍，表明此顯像劑特異性聚集在腫瘤部位的VEGFR上。Qin等[14]用188Re標(biāo)記VEGF-189，通過將VEGFR-2基因截斷后轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞再進(jìn)行標(biāo)記，可使188Re-VEGE-189與VEGFR的親和力增強，進(jìn)而提高腫瘤部位的T/NT值。

以上研究都是通過放射性核素標(biāo)記VEGF亞型，此外應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗VEGF抗體及其衍生物也有報道。貝伐單抗是抗VEGF-A單克隆抗體的人工化變體，針對所有的VEGF亞型，阻止它們與VEGFR-1和VEGFR-2相互作用。Nagengast等[15]研究證實，89Zr-貝伐單抗和111In-貝伐單抗可在人SKOV-3卵巢癌移植瘤裸鼠和人LS174T結(jié)腸癌種植裸鼠中進(jìn)行特異性顯像。同時，Nagengast等[16]用111In-貝伐單抗在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中進(jìn)行顯像，其中12例患者有9例可直觀顯像發(fā)現(xiàn)病灶。在進(jìn)行核醫(yī)學(xué)顯像后，肝轉(zhuǎn)移瘤被切除并進(jìn)一步行免疫組化分析，通過原位雜交和利用酶聯(lián)免疫吸附法證實，腫瘤提取物中有VEGF-A表達(dá)。在另一項臨床前的研究中，用111In-貝伐單抗和111In-蘭尼單抗在SKOV-3卵巢癌裸鼠中進(jìn)行SPECT顯像并進(jìn)行對比，二者在腫瘤部位均有較高攝取，111In-貝伐單抗在腫瘤部位攝取要高于111In-蘭尼單抗，但111In-蘭尼單抗在注射后較早顯像，更適合于監(jiān)控治療后VEGF表達(dá)的快速改變。

總之，用放射性核素125I、111In、99Tcm、188Re等標(biāo)記VEGF亞型及抗VEGF-A單克隆抗體，如貝伐單抗、蘭尼單抗等作為腫瘤血管生成的SPECT分子顯像劑，都有著很好的應(yīng)用前景。

2 αvβ3整合素受體SPECT顯像

整合素（integrins）是細(xì)胞黏附分子家族中的一類生物大分子，是由亞基以非共價鍵結(jié)合而形成的跨膜異二聚體糖蛋白，廣泛分布于細(xì)胞表面。迄今已發(fā)現(xiàn)18種不同的α亞單位和8種β亞單位，組成至少24種整合素，對細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡起著重要的調(diào)控作用，其中αvβ3整合素在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著重要作用。αvβ3整合素受體，也被稱為玻連蛋白受體，在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，在靜止的內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏。同時，αvβ3整合素受體也在卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、黑色素瘤等各種類型腫瘤細(xì)胞膜上有表達(dá)。存在于活化的內(nèi)皮細(xì)胞上的αvβ3整合素受體，可調(diào)節(jié)血管生成期間的細(xì)胞遷移和成活。存在于腫瘤細(xì)胞膜上的αvβ3整合素受體，可通過增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，鑒于腫瘤血管生成過程中αvβ3整合素受體的高表達(dá)和生物學(xué)作用，αvβ3整合素被認(rèn)為適合成為腫瘤血管生成顯像的靶分子[17]。

對于整合素αvβ3受體SPECT顯像而言，構(gòu)建分子探針常用的親和元件主要有整合素αvβ3單克隆抗體，如DM101、LM609以及整合素αvβ3的配體，即為含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列的多肽。Haubner等[18]研究證實，含有RGD序列的配體與整合素α、β具有特異性的高親和力，因此利用RGD與α、β整合素的特異性結(jié)合而設(shè)計的含有RGD的α、β整合素配體，作為SPECT顯像的分子探針得到廣泛的研究和應(yīng)用。

用放射性核素標(biāo)記αvβ3整合素配體，通過暴露的RGD的氨基酸部分與ECM蛋白（玻連蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白、膠原蛋白）結(jié)合而進(jìn)行顯像。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，Haubner等[19]設(shè)計了包含絡(luò)氨酸殘基的5個多肽，可被放射性碘化。其中兩個多肽，將葡萄糖基糖氨基酸（SAA1）共軛到五肽中的賴氨酸的ε氨基上，將其糖化后再用放射性碘標(biāo)記，然后在活體上進(jìn)行研究，與無糖化的肽比較，結(jié)果顯示：碘標(biāo)糖肽，即123I-gluco-RGD，在肝臟中濃聚減少，而在血液中的含量增加，同時也增加了腫瘤的攝取和滯留。

van Hagen等[20]研究證實，在循環(huán)五肽（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys）中的賴氨酸殘端ε氨基端結(jié)合上DTPA，導(dǎo)致αvβ3整合素配體能被111In和放射性碘標(biāo)記，放射性核素標(biāo)記后的αvβ3整合素配體可特異地結(jié)合到αvβ3表達(dá)陽性的細(xì)胞表面。與DTPA結(jié)合后的多肽更具親合力且可加速從腎中清除，而不與DTPA結(jié)合的放射性核素標(biāo)記的多肽，主要經(jīng)肝膽系統(tǒng)排泄。

Sivolapenko等[21]是第一個將人工合成RGD類似物（Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Tyr）在患者身上做腫瘤血管生成顯像研究的。采用99Tcm標(biāo)記多肽（Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Tgr）作為顯像劑，對14例黑色素瘤患者靜脈注射，劑量為185～1222MBq，3 h后進(jìn)行顯像，顯像劑很快從血液中清除，主要經(jīng)腎臟濾過和排泄（注射1 h后＞90%ID在腎臟和膀胱）。14例患者中共有22個腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，其中17個被發(fā)現(xiàn)。99Tcm標(biāo)記RGD包含肽（NC100692）在局部缺血的模型中評估顯示，在新生血管形成區(qū)域αvβ3高表達(dá)，表現(xiàn)高攝取[14]。該研究表明，在這些模型中，NC100692結(jié)合在血管生成區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的αvβ3整合素受體上。隨后，99Tcm-NC100692在病理證實的乳腺癌患者中顯像陽性，20例惡性腫瘤患者測到19例，由此可知，99Tcm-NC100692能有效地探測惡性乳腺腫瘤[22]。Bach-Gansom等[23]將99Tcm-NC100692用于25例晚期癌癥患者的研究中，其中包括15例肺癌、10例乳腺癌患者。在7例肝轉(zhuǎn)移者中99Tcm-NC100692檢測出1例，5例肺轉(zhuǎn)移檢測出4例[23]，17例骨轉(zhuǎn)移檢測出8例，1例腦轉(zhuǎn)移也被檢測到。由此作者推論，99Tcm-NC100692檢測肝轉(zhuǎn)移的敏感性較低，檢測骨轉(zhuǎn)移的敏感性較可疑，而檢測乳腺癌和肺癌患者的肺和腦轉(zhuǎn)移是可行的。

在另一項研究中，111In和99Tcm通過螯合劑DOTA和HYNIC標(biāo)記二聚體RGD，作為腫瘤靶分子在OVCAR-3荷瘤裸鼠中顯像，111In-DOTA-E-[c（RGDfK）]2作為顯像劑，注射后2 h在腫瘤部位攝取峰值為7.5%ID/g；99Tcm-HYNIC-E-[c（RGDfK）]2作為顯像劑，注射后1 h在腫瘤部位的攝取峰值為6.0%ID/g[24]。四聚體RGD類似物E{E[c（RGDfK）]2}2與DOTA共軛組成復(fù)合物使其呈現(xiàn)多價效應(yīng)，111In直接標(biāo)記，測定腫瘤表達(dá)的αvβ3整合素，結(jié)果顯示，通過四聚體標(biāo)記較二聚體標(biāo)記改進(jìn)了與腫瘤靶點的親和力[24]。同樣，二聚體較單一的RGD標(biāo)記改進(jìn)了與腫瘤靶點的親和力。二聚體和四聚體通過谷氨基酸樹將RGDfK偶聯(lián)起來，用作SPECT的顯像劑也已經(jīng)被廣泛地研究。所有的多聚體RGD顯示，多聚化的RGD肽環(huán)加強了它們與整合素αvβ3的親和力，同時也改進(jìn)了腫瘤對放射性顯像劑的攝取。但是也增加了顯像劑在腎和肝中的攝取。RGDxK的四聚體和八聚體太復(fù)雜，臨床應(yīng)用受到限制，有文獻(xiàn)報道，四聚體和八聚體更適合受體治療[24]。

綜上所述，有2個因素有助于增加多聚體RGD肽的αvβ3整合素親和力：①αvβ3整合素同時與2個RGD結(jié)合；②局部較高的RGD濃度。為了獲得瞬時整合素αvβ3的結(jié)合（多價），兩個RGD序列已足夠長且足夠靈活，而四聚體或八聚體RGD蛋白多肽相對應(yīng)二聚體也有不足之處，一是合成復(fù)雜，二是在非靶器官中濃聚也較高。在一個試圖增加二聚體RGD蛋白多肽E[c（RGDfK）]2親和力的研究中，Shi等[25]開發(fā)了一系列RGD二聚體環(huán)，包含三甘肽或聚乙二醇，用于增加2個RGD環(huán)間距離。在U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤和MDA-MB-435乳腺癌異體移植小鼠的研究中，99Tcm-HYNIC-3PEG4-二聚體和99Tcm-HYNIC-3G3-二聚體在腫瘤部位的攝取相似于99Tcm-HYNIC-四聚體，提示改造后的二聚體環(huán)可增加αvβ3整合素的親和力。而且，99Tcm-HYNIC-3PEG4-二聚體和99Tcm-HYNIC-3G3-二聚體在肝和腎中的攝取減少，是99Tcm-HYNIC-四聚體的50%。在隨后的研究中，111In-DOTA-3PEG4-二聚體、111In-DTPA-3PEG4-二聚體和111In-DTPABn-3PEG4-二聚體被合成，在試管和活體中被比較研究發(fā)現(xiàn)，他們的親和力分別是1.3±0.2、1.4±0.3和1.3±0.3 nmol/L。在異體移植U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠中，3種顯像劑在腫瘤部位都有較高的放射性攝取，并且腫瘤與本底比值（T/B）較高，可延續(xù)到注藥4 h后。在這個時間點之后，由DTPA共軛的派生物與DOTA共軛的派生物相比，前者腫瘤部位的放射性清除較快且T/B值較低。Terry等[26]在對頭頸部鱗癌患者的研究中證實，111In-RGD2可用于監(jiān)測放射治療后腫瘤生成血管的反應(yīng)，并且可為臨床提供一個好的工具來監(jiān)測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌開始放射治療后的早期腫瘤生成血管的治療反應(yīng)，同時也可監(jiān)測腫瘤抗血管生成治療效果，如果治療后腫瘤部位仍有111In-RGD2較高攝取，則表明整合素表達(dá)沒有被改變。總之，可以說3PEG4-二聚體和3G3-二聚體更適合成為臨床研究中腫瘤血管生成SPECT顯像的靶分子。

3 ECM SPECT顯像

在新形成的血管周圍有傾向性表達(dá)的纖連蛋白、層粘連蛋白、腱生蛋白、Ⅳ型膠原。其中纖連蛋白的額外域B作為靶點進(jìn)行腫瘤血管生成顯像已經(jīng)被研發(fā)。

纖連蛋白在ECM中是一個大的糖蛋白，纖連蛋白的額外域B是91個氨基酸序列，在小鼠、大鼠、人類中是相同的，嵌入到纖連蛋白分子中參與組織改建。纖連蛋白額外域B在腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)周圍和有血管生成的其他組織中特異性表達(dá)，但在正常成熟組織中不被發(fā)現(xiàn)。噬菌體展示技術(shù)可將針對纖連蛋白額外域B的單鏈抗體即L19提取。人類單鏈抗體L19對纖連蛋白額外域B有親和力。Demartis等[27]證實，123I-L19可選擇性地濃聚在侵襲性肺癌及結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的腫瘤部位。最近，Berndorff等[28]將氨基酸序列（Gly）3-Cys-Ala嵌入在L19的C端，使抗纖連蛋白額外域B單鏈抗體即AP39，可以用99Tcm標(biāo)記。研究結(jié)果顯示，99Tcm-L19在異體移植畸胎瘤裸鼠中靶向顯像的可行性。隨后，一系列不同的L19抗體模式被構(gòu)建，包括二聚單鏈抗體、人二價免疫蛋白、完整人免疫球蛋白G等。

比較這些用放射性核素標(biāo)記的不同的L19抗體模式，證實L19單列直插式最適合腫瘤ED-B表達(dá)的靶向顯像。

4 PSM A SPECT顯像

PSMA是一種在前列腺癌中過度表達(dá)的跨膜蛋白，111In標(biāo)記抗PSMA抗體明顯地濃聚在前列腺，這個抗體的制備經(jīng)過美國食品與藥品監(jiān)督管理局驗證可探測前列腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但這個抗體與細(xì)胞內(nèi)的PSAM表位拮抗，被認(rèn)為是次優(yōu)的免疫顯像靶分子。PSMA在許多實體腫瘤的新生血管內(nèi)皮中有表達(dá)，而在正常組織的內(nèi)皮中不表達(dá)[29]。J591是一個單克隆抗體，可結(jié)合到PSMA胞外域的表位。從前的研究已經(jīng)顯示，J591濃聚在前列腺癌的轉(zhuǎn)移部位。最近的研究證實，111In-J591檢測腺癌新生血管系統(tǒng)的可行性，在黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌及肝臟、腎臟中都有111In-J591濃聚[30]。以上研究顯示，PSMA可與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞選擇性地結(jié)合，111In-J591有潛力成為適合血管生成顯像的靶分子。

Vallabhajosula等[31]研究發(fā)現(xiàn)，用99Tcm標(biāo)記小分子PSMA抑制劑，可以較好地結(jié)合在異體移植的前列腺癌PSMA陽性表達(dá)腫瘤部位。將99Tcm-MIP-1404和99Tcm-MIP-1405分別在6名健康男性和6例診斷為前列腺癌轉(zhuǎn)移患者中進(jìn)行顯像，結(jié)果顯示，兩種顯像劑均可在血液中被快速清除，在唾液腺、淚腺、腮腺中可較持久的存留，1 h至2 h后肝臟和腎臟顯像劑減少到可允許顯像的程度。在前列腺癌患者中，兩種顯像劑在注射后1 h均可快速濃聚在受累的骨和淋巴結(jié)病灶上，且骨轉(zhuǎn)移灶與全身骨顯像相比有較好的相關(guān)性，但前者發(fā)現(xiàn)的骨轉(zhuǎn)移灶多于骨顯像，且能發(fā)現(xiàn)骨顯像不能發(fā)現(xiàn)的受累的軟組織，包括淋巴結(jié)。

5 結(jié)論

近年，SPECT顯像劑的研發(fā)在非侵襲性腫瘤血管生成顯像方面取得了很大進(jìn)步，包括多肽、蛋白質(zhì)、抗體等，此類顯像劑除具有早期診斷腫瘤患者并進(jìn)行臨床分期外，同時也具有選擇抗腫瘤血管生成藥物治療顯像的潛能，并且此類顯像劑也可用于評價抗腫瘤血管生成藥物的療效。

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Research advance onmolecular imaging of tumor angiogenesisw ith SPECT

Liu Xiaomei,Zhang Fang,Huang Jianmin.Department of Nuclear Medicine,the Third Hospital of HebeiMedical University, Shijiazhuang 050051,China

Liu Xiaomei,Email：ky121@163.com

Tumor Angiogenesis is one of the key requirements of tumor growth and metastasis. Tumour-induced angiogenesis is amultistep process that controlled by growth factors,cellular receptors and adhesionmolecules,such as vascular endothelial growth factor,αvβ3 integrin,extracellularmatrix proteins,prostate-specific membrane antige.They have become a common molecular targetwhich has a potential value in angiogenesismolecular imaging and therapy at present.It is an important subject of modernmedical imaging in developing a new imagingmethod which can accurate noninvasive assessment of tumorangiogenesisand tumoranti-angiogenesis therapy effect.

Angiogenesis；Vascular endothelial growth factor；αvβ3 integrin;Extracellular matrix proteins；Prostate-specificmembraneantige；Tomography，emission-computed，single photon

2014-10-27）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.02.015

050051石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

劉曉梅（Email：ky121@163.com）