范瑞杰，張安紅，徐慶陽

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 銀川，750021）

馬鈴薯渣酶解液發(fā)酵L-賴氨酸的優(yōu)化

范瑞杰1，2，張安紅2，徐慶陽1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 銀川，750021）

以馬鈴薯渣酶解濃縮液為碳源，黃色短桿菌為發(fā)酵菌株，利用響應(yīng)面法，分析了總糖（馬鈴薯渣酶解濃縮液添加量）、硫酸銨和玉米漿優(yōu)化培養(yǎng)基的最佳組成，進(jìn)而研究了生物素和二甲基亞砜的最佳用量。最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：總糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米漿18.17 m L/L，生物素180μg/L，二甲基亞砜18 m L/L，且在發(fā)酵18 h時添加二甲基亞砜較佳，L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到64.99 g/L，說明馬鈴薯渣可以作為發(fā)酵L-賴氨酸的原料。

馬鈴薯渣；L-賴氨酸；發(fā)酵

賴氨酸（L-Lysine），學(xué)名α，ε-二氨基己酸或2，6-二氨基己酸，存在L型和D型兩種同分異構(gòu)體，其中只有L-賴氨酸才具有生理活性，屬于人和動物自身不能合成的8種必需氨基酸之一。由于L-賴氨酸在谷物中缺乏最多，又被定義為谷物中的“第一限制性氨基酸”［1-2］。L-賴氨酸廣泛用于食品和飼料行業(yè)，并且隨著科學(xué)的發(fā)展，L-賴氨酸及其衍生物的醫(yī)學(xué)功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)［3］。目前賴基酸主要依靠發(fā)酵方法生產(chǎn)，發(fā)酵原料主要為玉米淀粉。近兩年玉米價格的上升導(dǎo)致玉米淀粉價格攀升，賴氨酸的市場形勢并不樂觀［4］，因此有必要尋找新的廉價碳源來代替玉米淀粉。

馬鈴薯渣除了制備果膠、膳食纖維和單細(xì)胞蛋白外，由于其淀粉、纖維素和果膠含量都很高，在發(fā)酵行業(yè)中的應(yīng)用也十分廣泛，已應(yīng)用于乙醇、檸檬酸、木聚糖酶等的生產(chǎn)方面［5-7］。但馬鈴薯渣在氨基酸發(fā)酵方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道，本文以馬鈴薯渣酶水解液為碳源，研究了馬鈴薯渣水解液作為碳源發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸的可行性，充分利用了馬鈴薯渣，節(jié)省了資源。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃色短桿菌TY（Brevibacterium flavum），寧夏伊品生物科技股份有限公司賴氨酸生產(chǎn)菌種。

1.2 主要儀器

L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；SBA生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；UV-2000紫外分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司。

1.3 主要試劑

馬鈴薯渣酶解濃縮液、玉米漿均由寧夏伊品生物科技股份有限公司提供，其中馬鈴薯渣酶解濃縮液總糖含量為200 g/L左右，還原糖濃度為160 g/L左右。L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5mmol/L），購自日本日立公司；瓊脂條、蛋白胨、酵母膏、生物素、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、苯酚紅、無水葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3等均為國產(chǎn)分析純。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 活化培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂條15.0 g/L，pH 7.0～7.2，121℃條件下滅菌15 min。

1.4.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 mg/L，生物素100μg/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基［8］

KH2PO44.0 g/L，玉米漿20.0 mL/L，CaCO35.0 g/L，(NH4)2SO420 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L， FeSO4·7H2O 0.01 g/L，生物素150μg/L，添加馬鈴薯渣酶解濃縮液，使培養(yǎng)基總糖含量為120 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121℃滅菌15min。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌種活化

取斜面保藏菌種劃線接種到斜面活化培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24 h左右。

1.5.2 種子培養(yǎng)

接一環(huán)生長良好的斜面種子至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，9層紗布封口，220 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)

取上述種子培養(yǎng)液以10%（V/V）接種量接到裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，9層紗布封口，220 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵過程中不斷補(bǔ)加濃氨水以增加氮源來維持穩(wěn)定的pH值。同時根據(jù)每隔一段時間測得的殘?zhí)橇縼砼袛嗉犹橇浚a(bǔ)加一定濃度的馬鈴薯酶解濃縮液提供充足碳源，從而確保菌體的正常生長。搖瓶發(fā)酵時加入兩滴2.0%的苯酚紅作為發(fā)酵指示劑。

1.5.4 L-賴氨酸的發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)［9-10］

在培養(yǎng)基初始總糖為120 g/L，玉米漿濃度為20.0 mL/L，(NH4)2SO4濃度為20 g/L的基礎(chǔ)上，控制變量，分別設(shè)置不同單因素水平，培養(yǎng)基總糖濃度為100、120、140、160、180 g/L，玉米漿濃度8、13、18、23、28 mL/L，(NH4)2SO4濃度15、20、25、30、35 g/L，其他同1.4.3發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定總糖、玉米漿和(NH4)2SO4合適濃度。

1.5.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以總糖初始濃度、(NH4)2SO4初始濃度和玉米漿濃度為考察因素，以L-賴氨酸的產(chǎn)量（g/L）為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.6 生物素和二甲基亞砜濃度的確定［8，11］

在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別控制生物素濃度90、120、150、180、210μg/L，二甲基亞砜濃度12、15、18、21、24 mL/L，檢測賴氨酸的產(chǎn)量，確定合適添加量。

1.5.7 二甲基亞砜添加時間的確定

在最優(yōu)二甲基亞砜添加量的基礎(chǔ)上，分別在發(fā)酵16、18、20、22、24 h后添加二甲基亞砜，并檢測72 h后的發(fā)酵產(chǎn)量。

1.5.8發(fā)酵液中L-賴氨酸含量的測定

將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，并用蒸餾水定容至刻度。取發(fā)酵液1.0 mL，再用超純水定容至100 mL，經(jīng)0.22μm水系膜過濾后，上氨基酸分析儀進(jìn)行測定。用0.01 mol/L的鹽酸將賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到0.1 mmol/mL。進(jìn)樣量均為20μL，具體操作方法按照日立L-8900氨基酸分析儀自帶分析方法，定量方法為單點(diǎn)校正法。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬鈴薯酶解液添加量（總糖）對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

由圖1可知，在賴氨酸發(fā)酵初始，隨總糖濃度的增加，L-賴氨酸先增加后降低，120 g/L時達(dá)到最大。因此總糖以120 g/L為宜，此時賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)54.02 g/L，再添加馬鈴薯酶解液以增加總糖量，賴氨酸產(chǎn)量逐漸降低，可能是過高的滲透壓不利于發(fā)酵。

圖1 總糖濃度對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

2.2 玉米漿濃度對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

圖2顯示在賴氨酸發(fā)酵的初始，隨玉米漿添加量的增加，L-賴氨酸先迅速增加，當(dāng)玉米漿濃度達(dá)到18 mL/L時達(dá)到最大，再增加玉米漿濃度，L-賴氨酸產(chǎn)量開始下降。所以玉米漿的濃度不宜過高，此時賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)44.02 g/L。

圖2 玉米漿添加量對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

2.3 （NH4）2SO4濃度對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

由圖3看出，在賴氨酸發(fā)酵初始，隨硫酸銨添加量的增加，賴氨酸產(chǎn)量迅速增加，硫酸銨濃度為25 g/L時，L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大，達(dá)到49.99 g/L，再增加硫酸銨的量，L-賴氨酸產(chǎn)量降低。

圖3 （NH4）2SO4添加量對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件

對單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平如表1所示，試驗(yàn)安排及結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2顯示了析因?qū)嶒?yàn)和中心試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，可建立回歸方程如下：

賴氨酸產(chǎn)量=54.51+6.8A+1.76B+11.77C-0.0013AB+0.005AC-3.42BC-11.71A2-2.21B2-13.15C2。

對該回歸方程進(jìn)行方差分析，見表3。由表3可知，該回歸方程（p值＜0.0001）高度顯著，失擬項(xiàng)（p值=0.9780）不顯著，說明L-賴氨酸與總糖濃度（A）、玉米漿濃度（B）和(NH4)2SO4濃度（C）存在函數(shù)關(guān)系，其復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9967，模型擬合程度很好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用此方法來預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)條件。

表3 回歸方程的方差分析

2.5 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

利用Design expert繪制的響應(yīng)曲面和等高線如圖4～6所示。從響應(yīng)面的最高值和等高線可以看出，存在賴氨酸產(chǎn)量的最大值，圖中可以反映因素與因素之間交互效應(yīng)［12］。從圖5可以看出，無論是固定總糖的量，還是硫酸銨的量，改變另一個自變量，均能對L-賴氨酸產(chǎn)量有較大影響。可以看出隨總糖和(NH4)2SO4濃度的升高，L-賴氨酸產(chǎn)量先增加后降低。而從圖4可以看出，固定玉米漿的量，逐漸增加總糖的量，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量變化明顯；而固定總糖的量，改變玉米漿的量，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量改變緩慢。在圖6中，固定玉米漿的量，改變硫酸銨的量，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量改變明顯；相反固定硫酸銨的量，改變玉米漿濃度，發(fā)現(xiàn)玉米漿濃度的升降對L-賴氨酸產(chǎn)量影響不明顯。說明總糖和硫酸銨對L-賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響，而玉米漿對L-賴氨酸的影響相對較小。

利用設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行分析，可以得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：總糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米漿18.17mL/L。對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組成進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)得到的賴氨酸產(chǎn)量的平均值是59.66 g/L，與預(yù)測值（58.136 g/L）相對誤差小于5%，吻合度較高，說明此模型能夠較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況，且馬鈴薯水解液作為部分碳源用于發(fā)酵是可行的。

寧夏伊品生物科技股份有限公司以玉米淀粉水解液為碳源，利用本實(shí)驗(yàn)黃色短桿菌發(fā)酵賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)到100 g/L以上；周勇等［13］在7 L發(fā)酵罐中，以葡萄糖為碳源發(fā)酵L-賴氨酸，產(chǎn)量可達(dá)161 g/L；白潔等［14］以酶處理甘蔗糖蜜為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸達(dá)95 g/L。本實(shí)驗(yàn)中僅為59.66 g/L，說明碳源對于L-賴氨酸的影響非常大，說明如果改變傳統(tǒng)碳源（主要是葡萄糖，或者淀粉水解葡萄糖）高產(chǎn)發(fā)酵賴氨酸，必須要重新考慮發(fā)酵工藝或者改善菌種。

圖4 總糖和玉米漿濃度對L-賴氨酸產(chǎn)量影響

圖5 總糖和（NH4）2SO4濃度對L-賴氨酸產(chǎn)量影響

圖6 （NH4）2SO4濃度和玉米漿添加量對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響

圖7 生物素添加量對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響

圖8 二甲基亞砜添加量對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響

2.6 生物素添加量對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

由圖7可知，在賴氨酸發(fā)酵的初始，隨生物素添加量的增加，L-賴氨酸產(chǎn)量先迅速增加，120 μg/L后增加速度減緩，達(dá)到180μg/L后其產(chǎn)量可達(dá)63.01 g/L，再增加生物素的量，賴氨酸產(chǎn)量迅速下降?？赡茉蚴钱?dāng)生物素亞適量時，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成不完全，導(dǎo)致磷脂合成不完全，從而增加細(xì)胞膜通透性，利于L-賴氨酸由膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外。當(dāng)生物素添加過量時，細(xì)胞內(nèi)會有大量磷脂積累，引起細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁變厚，不利于賴氨酸分泌，局部的賴氨酸過高，又會抑制發(fā)酵，造成賴氨酸產(chǎn)酸率降低［15］。

2.7 不同二甲基亞砜添加量對L-賴氨酸發(fā)酵的影響

圖8表明，隨二甲基亞砜添加量的增加，添加量少于18mL/L時，L-賴氨酸呈增加趨勢，添加量大于18mL/L，L-賴氨酸先迅速降低后緩慢降低。據(jù)報(bào)道，二甲基亞砜增加賴氨酸產(chǎn)量是增加了細(xì)胞膜的透性，也有報(bào)道說二甲基亞砜能夠刺激微生物的代謝。但是過多的二甲基亞砜會導(dǎo)致細(xì)胞代謝下降，主要原因是二甲基亞砜本身就有一定毒性，會導(dǎo)致菌體死亡［16-17］。因此二甲基亞砜添加量以18mL/L為宜，此時賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)64.99 g/L。

2.8 二甲基亞砜添加時間對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響

由圖9可以看出，在發(fā)酵16～18 h期間加入二甲基亞砜，L-賴氨酸產(chǎn)量增加；發(fā)酵18 h后加入二甲基亞砜，L-賴氨酸產(chǎn)量下降速率逐漸增大。所以發(fā)酵18 h時加入二甲基亞砜，L-賴氨酸產(chǎn)量最高。因此，二甲基亞砜最佳加入時間為發(fā)酵18 h時。

圖9 不同時間加入二甲基亞砜對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，利用黃色短桿菌研究了馬鈴薯水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的培養(yǎng)條件。在未經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件下，發(fā)酵72 h，L-賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)48.29 g/L。

利用響應(yīng)面法考察了馬鈴薯酶解濃縮液、硫酸銨和玉米漿的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成，以及生物素和二甲基亞砜對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響。最終確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：總糖125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，玉米漿18.17mL/L，磷酸二氫鉀4.0 g/L，生物素180μg/L，二甲基亞砜18 m L/L，MgSO4· 7H2O 2.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCO35.0 g/L，且在發(fā)酵18 h時添加二甲基亞砜較佳，此時L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到64.99 g/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明利用馬鈴薯渣作為碳源是可行的，但是以馬鈴薯渣酶解液為碳源發(fā)酵L-賴氨酸產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于當(dāng)今工業(yè)水平，提高產(chǎn)量還需要在菌種選育和發(fā)酵控制上作進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Optim ization of L-lysine fermentation w ith enzymatic hydrolysate of potato pomace as carbon source

FAN Ruijie1，2，ZHANG Anhong2，XU Qingyang1
(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750021，China)

In this study，fermentation of L-lysine by Brevibacterium flavum with condensed enzymatic hydrolysate of potato pomace as carbon source was investigated.The composition of total sugar(the amount of condensed enzymatic hydrolysate of potato pomace)，ammonium sulfate and corn steep liquor of the medium was optimized with response surface methodology.The optimal dosage of biotin and dimethyl sulfoxide(DMSO)was further analyzed based on the optimized medium.The final optimum fermentation condition was as follows：total sugar 125.81 g/L，(NH4)2SO427.20 g/L，corn steep liquor 18.17 mL/L，biotin 180μg/L，DMSO 18mL/L.The DMSO was added after 18 h fermentation.The production of lysine reached 68.19 g/L and was 41.21%higher than that of non-optimal culture.The potato pomace was suitable carbon source for L-lysine fermentation.

potato pomace；L-lysine；fermentation

TQ922.3

A

1674-2214(2015)04-0034-06

2015-09-23

范瑞杰（1983—），男，寧夏銀川人，碩士，研究方向?yàn)樯锕こ?，E-mail：fanruijie1717@163.com.