制備角膜新生血管動物模型的研究進(jìn)展

王淑榮,田舒慈,劉 鑫,何宇茜,李 瑩,蘇冠方,張 妍

制備角膜新生血管動物模型的研究進(jìn)展

王淑榮1,田舒慈2,劉 鑫1,何宇茜1,李 瑩1,蘇冠方1,張 妍1

結(jié)膜中的血管過度生長并延伸入角膜形成角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)。血管的異常增生通常來源于角膜受損及自我修復(fù),這是新生血管形成的重要過程。血管的病理性增生阻礙光在眼球內(nèi)的傳播,促進(jìn)瘢痕形成并引起炎癥反應(yīng)。角膜新生血管會嚴(yán)重影響視力,甚至導(dǎo)致失明。新生血管性眼病是臨床上最常見的問題之一。因此進(jìn)一步的角膜新生血管機(jī)制研究是防治新生血管性眼病的關(guān)鍵。角膜新生血管動物模型的選擇對研究具有重要意義。本文主要就幾種角膜新生血管模型的制備方法作一綜述。

角膜;新生血管;模型;制備

0 引言

血管生成是自然生理過程,根據(jù)發(fā)生部位和時間的不同,血管形成對機(jī)體產(chǎn)生的的影響不同。在人體大多數(shù)組織中,它參與組織細(xì)胞的生長和受損組織的修復(fù)。生理狀態(tài)下,毛細(xì)血管網(wǎng)僅圍繞角膜緣生長,不會延伸至角膜,角膜保持透明狀態(tài)。在炎癥、外傷、手術(shù)等不良狀態(tài)下,毛細(xì)血管會侵入角膜,產(chǎn)生病理性CNV。其病理過程主要與作用于血管的細(xì)胞因子有關(guān):作用于血管的細(xì)胞因子在血管形成過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)等促進(jìn)因子和基質(zhì)金屬蛋白(matrix metalloproteinases,MMPs),白細(xì)胞介素(IL-1)等抑制因子。血管形成過程受到許多促進(jìn)因子和抑制因子的調(diào)控。在正常的生理狀態(tài)下,抑制因子占優(yōu)勢,兩種因子的濃度會達(dá)到平衡以角膜保持生理狀態(tài)。當(dāng)濃度平衡被打破時,促血管生長的細(xì)胞因子會促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入角膜,形成毛細(xì)血管[1]。

作用于血管的細(xì)胞因子的過表達(dá)與下列因素有關(guān)[2-3]:(1)角膜水腫:角膜水腫時,角膜組織間壓力減小,血管容易長入[4]。(2)炎性反應(yīng):炎細(xì)胞的浸潤導(dǎo)致細(xì)胞碎片形成,這些細(xì)胞碎片在新生的血管周圍可見,對血管生成有促進(jìn)作用[4]。(3)缺氧:缺氧條件可刺激促血管生成的細(xì)胞因子大量表達(dá)。(4)角膜神經(jīng)纖維分布:新的研究發(fā)現(xiàn),角膜感覺神經(jīng)與新生血管形成是互相抑制的。角膜新生血管形成與神經(jīng)的損傷也可能存在聯(lián)系[5]。

角膜新生血管動物模型是通過手術(shù)、物理、化學(xué)、生物等方法,人為誘發(fā)動物角膜新生血管增生,產(chǎn)生類似于人類疾病的模型,是誘發(fā)性疾病動物模型。CNV模型需要具備以下特點:(1)制作簡便,模型穩(wěn)定;(2)實驗條件

引用:王淑榮,田舒慈,劉鑫,等.制備角膜新生血管動物模型的研究進(jìn)展.國際眼科雜志2015;15(11):1892-1895和操作簡單,血管形成規(guī)則;(3)個體間差異較小;(4)其他條件容易控制。實驗中應(yīng)當(dāng)遵守研究用動物的Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)決議[6]?，F(xiàn)以家兔為實驗?zāi)Ｐ?從造模方法、效果、原理、優(yōu)劣幾方面對幾種CNV的動物模型制備方法作介紹。

1 誘導(dǎo)炎癥性CNV模型

1.1 物理方法誘導(dǎo)的CNV模型

1.1.1 角膜縫線法造模方法:家兔全身麻醉和眼表麻醉,顯微鏡下用開瞼器置開眼瞼,在距角鞏膜緣1.0mm處進(jìn)針,穿過角膜半厚度,經(jīng)過3mm寬出針,正反兩方向打結(jié)后剪掉線頭[7]。術(shù)后為預(yù)防感染,眼表滴抗生素眼液。效果:縫線后3～8d可見毛細(xì)血管芽由角膜緣長入, 14～18d血管生長達(dá)到高峰。新生血管在僅縫線兩側(cè)呈刷狀生長,未涉及角膜整個圓周。原理:此模型主要通過角膜損傷所致炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)新生血管。基質(zhì)內(nèi)縫線埋入引起了角膜縫線部位局部水腫,炎癥細(xì)胞侵入[8],此外,角膜縫線還會導(dǎo)致角膜上皮、基底細(xì)胞損傷而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。一方面,炎癥反應(yīng)中炎細(xì)胞會分泌促血管生長的細(xì)胞因子,促進(jìn)血管生成;另一方面,角膜損傷造成的角膜微環(huán)境缺氧也會促進(jìn)VEGF等促血管生成細(xì)胞因子的表達(dá),從而促進(jìn)血管生成[9]。優(yōu)點:縫線法誘導(dǎo)新生血管的方法成本低、所需實驗器材簡單、操作過程簡單、新生血管生長比較規(guī)則、而且避免了化學(xué)誘導(dǎo)方法中一些化學(xué)試劑的影響[10]。缺點:縫線成功與否受術(shù)者技巧影響較大,若縫線位于角膜基質(zhì)層較深處,容易導(dǎo)致角膜穿孔,若縫線稍淺則容易脫線致使模型失敗[10]。應(yīng)用現(xiàn)狀:由于此模型簡單易行,成本低廉,被廣泛應(yīng)用于新生血管的相關(guān)研究中。

1.1.2 熱灼傷法目前國內(nèi)外關(guān)于角膜熱灼傷后繼發(fā)新生血管的動物模型的研究報道較少,角膜熱燒傷后新生血管的基礎(chǔ)研究并不深入。現(xiàn)今研究者多利用恒溫灼傷器進(jìn)行角膜熱灼傷。造模方法[11]:設(shè)定燒灼器達(dá)到預(yù)定溫度。家兔進(jìn)行全身麻醉和眼表麻醉。顯微鏡下用開瞼器開瞼,用棉簽拭去角膜表面液體干燥角膜,探頭凹面貼緊角膜中央?yún)^(qū)域燒灼,燒灼5s后離開,立即用大量生理鹽水沖洗角膜。術(shù)后為預(yù)防感染,眼表滴抗生素眼液。效果[11]:燒灼術(shù)后第5～8d,可見毛細(xì)血管從角鞏膜緣長入;在第14d左右,新生血管生長達(dá)到高峰。原理:熱灼傷主要是通過引起角膜炎癥反應(yīng)來誘發(fā)CNV。Cooper等[12]認(rèn)為:前列腺素在血管生成過程中也發(fā)揮重要作用。角膜損傷后前列腺素高表達(dá),啟動并維持促血管生長因子,促進(jìn)新生血管增殖。優(yōu)點:此模型建立簡單易行,所需儀器不復(fù)雜,對角膜損傷較小。缺點:此方法灼傷力度難以控制,力度過大而容易致角膜穿孔,形成瘢痕導(dǎo)致造模失敗。應(yīng)用現(xiàn)狀:此模并不常用。國內(nèi)此方面報道較少。

1.2 化學(xué)方法誘導(dǎo)的CNV模型化學(xué)燒傷法:此方法利用堿性化學(xué)藥物與直接角膜表面接觸,導(dǎo)致角膜損傷,誘發(fā)新生血管形成。氫氧化鈉是實驗研究中最常用的化學(xué)藥物。造模方法[13]:家兔全身麻醉和眼表麻醉。將直徑為5mm濾紙片在1.0mol/L氫氧化鈉浸泡過后放置在距離角膜緣1.5mm的角膜表面約30s,之后立即移除濾紙片,用大量生理鹽水沖洗眼球2min。術(shù)后為預(yù)防感染,眼表滴抗生素眼液。此外,郭立云等[14]經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),bFGF和堿燒傷聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)新生血管,既可以增加并且維持角膜新生血管,又降低了燒傷的強(qiáng)度,一定程度上降低了溶解、脫出等并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險,提高了模型制作的成功率。效果:術(shù)后第3d,可見兔角鞏膜緣處毛細(xì)血管網(wǎng)擴(kuò)張,毛細(xì)血管芽呈刷狀快速生長,延伸深入角膜。第7d,新生血管達(dá)到生長高峰。原理:堿性物質(zhì)主要是通過引起角膜炎癥反應(yīng)來誘發(fā)新生血管,浸潤的炎細(xì)胞可以表達(dá)VEGF,促進(jìn)新生血管形成。堿進(jìn)入細(xì)胞后可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和眼部血栓形成,組織缺血缺氧。新生血管形成的免疫機(jī)制在近年來被廣泛認(rèn)可:堿性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使角膜蛋白變性成為抗原而刺激機(jī)體液免疫反應(yīng)。創(chuàng)傷角膜還會刺激組織產(chǎn)生血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)等趨化性細(xì)胞因子,引起多核中性粒白細(xì)胞趨化進(jìn)入角膜,淋巴因子如TNF-α等表達(dá)也參與引發(fā)并維持角膜炎癥反應(yīng)[15]。優(yōu)點:此模型很好地模擬了臨床上人角膜堿燒傷疾病的病理過程。而且此模型一般不會引起角膜穿孔,不會影響新生血管的測定,角膜組織可以更好的保存,有利于免疫熒光中著色,而且此造模方法成本低,操作容易[16]。應(yīng)用現(xiàn)狀:堿燒傷法誘導(dǎo)角膜新生血管是最常用的造模方法,廣泛應(yīng)用于角膜新生血管的相關(guān)研究。

2 角膜層間植入誘導(dǎo)劑模型

角膜層間植入誘導(dǎo)劑模型多用于鑒定血管形成過程中的刺激因子,或用于研究血管生成或抑制劑,新生血管可以量化[17]。建立的基本方法為:手術(shù)做一角膜切口,將含有能夠刺激血管增殖的誘導(dǎo)劑埋置于角膜層間以誘導(dǎo)CNV形成。常用誘導(dǎo)劑有VEGF,bFGF,白細(xì)胞介素-1(IL-1),內(nèi)毒素,二氧化硅等。

2.1 VEGF緩釋藥丸誘導(dǎo)法造模方法[18]:制備VEGF緩釋藥丸:準(zhǔn)備可溶于任何緩沖溶液的同型VEGF165 (165個氨基酸)的聚合物,每粒包含5μg。VEGF因子的植入和緩釋需要VEGF保持在半固體狀態(tài)。準(zhǔn)備VEGF和其它實驗用品。利用硫糖鋁制備VEGF緩釋藥丸,每粒包含大約100ng或200ngVEGF。無菌條件下將VEGF緩釋藥丸植入角膜層間。效果[19]:24h后角膜出現(xiàn)輕微水腫。植入200ngVEGF的角膜術(shù)后2d出現(xiàn)邊緣血管擴(kuò)張。第3d,邊緣血管延伸入角膜,在之后2d內(nèi),新生血管延伸至藥丸處,第6d新生血管侵占藥丸。第7d,血管生長趨于穩(wěn)定。植入較小劑量VEGF(100ng)的新生血管反應(yīng)程度較小。此外,自第7d起在植入200ng角膜中出現(xiàn)輕微間質(zhì)水腫和組織出血現(xiàn)象,但是這種現(xiàn)象并沒有出現(xiàn)在小劑量VEGF處理的角膜。原理:VEGF是一種多肽細(xì)胞因子,是調(diào)控CNV形成的最重要因子,是血管形成的“調(diào)控中心”[19]。有研究表明,VEGF通過作用于以下幾個步驟促進(jìn)血管生成:原始血管中蛋白質(zhì)的水解,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,毛細(xì)血管的形成[18]。VEGF可以直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞,與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶和下游細(xì)胞的信號級聯(lián)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移[20]。優(yōu)點:VEGF是刺激新生血管形成的直接因素,可以避免炎癥刺激等其他因素的影響。

2.2 bFGF緩釋藥丸誘導(dǎo)法造模方法[21]:首先制備bFGF緩釋藥丸:顯微鏡下將醫(yī)用明膠海綿片剪成1mm× 1mm×0.5mm的小片,浸入4℃PBS緩沖液過夜后,用無菌濾紙將水份吸干。于明膠海綿小片上滴加1μL(500ng/μL PBS)bFGF,完全吸收后將小片置于超凈臺內(nèi)干燥48 h。取出將此小丸浸入20g/L瓊脂糖溶液包裹后置于超凈臺內(nèi)干燥48h。無菌條件下將bFGF藥丸植入角膜層間。效果:手術(shù)后1～4d,可見局部角膜輕度水腫,毛細(xì)血管芽自角膜緣長出,血管成束向植入物方向延伸,血管生長范圍較小且管徑較細(xì)。此后,角膜新生血管逐漸融合,管徑變粗,向角膜中心延伸并逐漸包裹藥丸。7～10d血管生長達(dá)到高峰,角膜基質(zhì)明顯充血,血管密集,管徑粗大,完全包裹植入物。14d以后新生血開始消退[21]。原理:bFGF可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移,通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂而刺激血管形成。此外bFGF通過對有絲分裂的影響和與一種有絲分裂無關(guān)的類激素活動的影響增加毛細(xì)血管生成,引起角膜新生血管[22]。bFGF誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的尿激酶型纖溶酶激活物(urokinase type plasminogen activator,u-PA)在早期血管生成起作用,產(chǎn)生有活性的纖維蛋白溶酶,激活膠原酶溶解血管邊緣的膠原蛋白,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化,遷移至三維的膠原基質(zhì),誘導(dǎo)血管形成[23-25]。此外,Yang等[26]發(fā)現(xiàn)bFGF對新血管形成的影響與積極的線性關(guān)系相關(guān)劑量。優(yōu)點:bFGF是血管生成的直接促進(jìn)因子,能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂,可排除炎癥等間接的新生血管刺激因素,有利于新生血管抑制劑的療效評價。缺點:該模型制作操作復(fù)雜,影響因素多。

2.3 內(nèi)毒素緩釋聚合物誘導(dǎo)法這種方法是通過在角膜層間植入內(nèi)毒素緩釋聚合物誘導(dǎo)新生血管形成。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的組成部分,其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖。這是研究血管生成抑制劑的可靠模型。造模方法[27-28]:制備內(nèi)毒素藥丸:制備分別含緩釋聚合內(nèi)毒素15%、30%、40%的藥丸,乙烯醋酸乙烯酯共聚物珠用高純度乙醇沖洗達(dá)到分光光度純度,室溫條件下,將內(nèi)毒素藥丸溶解于二氯甲烷中至濃度10%。將模具放在干冰上預(yù)冷卻,在工作表面一面覆蓋玻璃板,放止內(nèi)毒素在模具中濃縮,用無菌玻璃管取內(nèi)毒素-Elvax聚合。固體放置于-20℃條件下24h完成聚合,自然揮發(fā)48h蒸發(fā)殘余溶劑。聚合物顆粒切成種1mg藥丸,植入之前用紫外線照射消毒。無菌條件下將內(nèi)毒素藥丸角膜層間。效果[29]:結(jié)果顯示,植入含15%內(nèi)毒素的角膜產(chǎn)生輕微的角膜水腫,術(shù)后只持續(xù)3～4d。更高水平的內(nèi)毒素(30%和40%)誘導(dǎo)良好的新生血管反應(yīng)并在24h內(nèi)伴隨嚴(yán)重的角膜水腫。組織學(xué)檢查角膜,植入含15%內(nèi)毒素藥丸的一組顯示,植入后16d新生血管從角膜邊緣長入角膜囊袋。內(nèi)毒素誘生CNV對局部內(nèi)毒素有依賴性,對內(nèi)毒素濃度的嚴(yán)格控制可以誘導(dǎo)不同程度的模型適應(yīng)研究需求。內(nèi)毒素濃度過高會導(dǎo)致基質(zhì)混濁,血管生長過密且容易相互吻合,影響血管的定量測定。但是如果內(nèi)毒素濃度過低,新生血管數(shù)量過少,難以達(dá)到模型要求[28]。優(yōu)點:內(nèi)毒素誘導(dǎo)的CNV動物模型的優(yōu)點為誘導(dǎo)的新生血管范圍僅占角膜整個圓周的10%～20%,便于進(jìn)行動態(tài)定量測定,并且術(shù)者可以通過控制植入緩釋內(nèi)毒素聚合物的濃度誘導(dǎo)出重度、中度、輕度CNV模型,適應(yīng)不同研究需要[29]。缺點:操作復(fù)雜,影響因素多,手術(shù)創(chuàng)傷本身即可引起CNV形成,影響實驗結(jié)果的判定。

3 免疫原性CNV模型

免疫原性家兔CNV模型的制作包括異種或同種異體角膜移植、角膜基質(zhì)內(nèi)注射牛蛋白(BA)等方法。同種異體角膜移植誘導(dǎo)免疫原性CNV模型。造模方法[30]:在實驗動物家兔中隨機(jī)抽取一部分作為供體,另一部分作為受體。取下供體眼球,剪下角膜用環(huán)鉆切割后制成植片。麻醉受體兔,用7.25mm環(huán)鉆切割受體角膜制作受體植床。對稱地縫合植片與植床,共計12～16針。術(shù)后為預(yù)防感染,眼表滴抗生素眼液。效果[30]:術(shù)后可觀察到毛細(xì)血管芽自角膜緣向透明角膜長入,向植片中央生長并逐漸包繞植片,植片發(fā)生水腫,最后植片植床產(chǎn)生排斥反應(yīng),植片的平均存活時間為11.0±1.5d。原理:當(dāng)同種異體角膜進(jìn)入機(jī)體時,會被受體免疫系統(tǒng)識別而成為抗原刺激產(chǎn)生機(jī)體液免疫反應(yīng),形成免疫復(fù)合物并沉積于毛細(xì)血管基底膜和角膜組織中,由此激活補(bǔ)體,趨化單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)浸潤,誘導(dǎo)血管生成[31]。優(yōu)點:該模型CNV發(fā)生機(jī)制與人角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)而誘發(fā)CNV的機(jī)制一致,與人類疾病病程非常相近,是研究人角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)機(jī)制、發(fā)病原因、及治療的理想模型。缺點:操作復(fù)雜,手術(shù)技術(shù)要求較高,干擾因素較多,供體受體發(fā)生免疫排斥的程度差異較大。應(yīng)用現(xiàn)狀:此方法多應(yīng)用于疫排斥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制及治療方法的研究中[32-33]。

4 其他家兔CNV模型

能夠誘導(dǎo)CNV增生的原因多種多樣,目前也已經(jīng)培育出多種動物模型用于研究引起某疾病的原因。除以上CNV模型的獲得方式以外,還有一些不常用的造模方式,如對家兔角膜上皮機(jī)械刮除、角膜基質(zhì)中腫瘤組織植入術(shù)、機(jī)械造瓣等方法用于制作動物CNV模型[34]。與上述模型相比較來看,這些模型基本上均有更加明顯的缺點,如造模后反應(yīng)一致性較差,基線難于控制在同一水平線,定量分析比較困難等[35-36]。

以上幾種CNV造模方法各有利弊,其中角膜縫線法和堿燒傷法成本較低、操作簡單,是目前實驗研究中最為廣泛應(yīng)用的兩種;角膜層間植入誘導(dǎo)劑模型主要應(yīng)用于血管形成過程中對特定刺激因子的研究;免疫原性CNV模型主要用于角膜移植后發(fā)生免疫排斥的研究。CNV動物模型的研究是人類新生血管性眼病疾病研究的基礎(chǔ),目前來看現(xiàn)有的實驗?zāi)Ｐ鸵涯軌虼笾聫?fù)制出各種引起CNV的主要因素,滿足研究需要,模擬出臨床上人類CNV的疾病表現(xiàn)。

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Progress on the establishment of corneal neovascularization animal model

Shu-Rong Wang1,Shu-Ci Tian2,Xin Liu1,Yu-Xi He1,Ying Li1,Guan-Fang Su1,Yan Zhang1

1Department of Ophthalmology,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China;2Norman Bethune Health Science Center of Jilin University,Changchun 130021,China

Foundation item:International Cooperation Project of Science and Technology Office of Jilin(No.20130413025GH)

Yan Zhang.Department of Ophthalmology,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China. zhangy66@jlu.edu.cn

·Corneal neovascularization(CNV)is the extensive growth of blood vessels from conjunctiva into cornea. Abnormal angiogenesis plays an importantrole in the process of CNV,which may result from corneal wound and self-healing.The pathologic growth of blood vessels blocks light,promotes scar formation and causes inflammation,which impairs visual acuity.It is a sight threatening condition that can decreases eyesight and even leads to blindness.Neovascular eye disease is one of the most common eye diseases in clinical admissions. So,further mechanistic studies are the key to the prevention and treatment of CNV.Determination on the CNV animal models is essential in eye diseases researches.Several main methods of CNV mode ls establishment are summarized in this review.

cornea;vascularization;model;establishment

吉林省科技廳國際合作項目(No.20130413025GH)

作者單位:1(130041)中國吉林省長春市,吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科醫(yī)院;2(130021)中國吉林省長春市,吉林大學(xué)諾爾曼白求恩健康研究中心

王淑榮,博士,副主任醫(yī)師,研究方向:眼表疾病。

張妍,博士,主治醫(yī)師,研究方向:眼表疾病.zhangy66 @jlu.edu.cn

2015-06-03

2015-10-22

:Wang SR,Tian SR,Liu X,et al.Progress on the establishment of corneal neovascularization animal model.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1892-1895

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.14

Received:2015-06-03 Accepted:2015-10-22