戴麗荷，褚曉紅，路伏增，黃孫平，徐如海

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江省畜禽遺傳育種工程技術(shù)研究中心，杭州 310021)

靶向豬ATGL基因的miRNA預(yù)測及鑒定

戴麗荷，褚曉紅，路伏增，黃孫平，徐如海*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江省畜禽遺傳育種工程技術(shù)研究中心，杭州 310021)

本試驗旨在初步篩選出調(diào)控豬脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息學(xué)分析預(yù)測10條靶向ATGL基因的豬miRNAs，然后通過裝載含豬ATGL基因3′UTR序列來構(gòu)建pMIR-Luc報告基因載體，以及通過裝載含反向miRNA種子區(qū)對應(yīng)的3′UTR序列來構(gòu)建3個突變載體作為陰性對照，以pRL-TK載體作為內(nèi)參，與候選miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，最終利用雙熒光素酶報告基因法來檢測熒光素酶活性。試驗成功構(gòu)建了含豬ATGL基因3′UTR序列的重組載體pMIR-ATGL-3′UTR，雙熒光素酶報告基因試驗顯示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下調(diào)293T細(xì)胞中pMIR-ATGL-3′UTR的熒光素酶活性，而點突變試驗證實了ssc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p能通過與豬ATGL基因3′UTR上預(yù)測的種子區(qū)結(jié)合下調(diào)熒光素酶活性。結(jié)果表明，sc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p通過靶向結(jié)合3′UTR對豬ATGL基因有下調(diào)作用。

豬；ATGL基因；miRNA；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)；3′UTR

脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)是2004年由3個不同的研究小組在人和小鼠中幾乎同時發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪分解酶，官方命名為PNPLA2，又名為TTS-2.2(iPLA2ζ)，desnutrin和PEDF-R等[1-3]。當(dāng)機體需要能量時，在脂肪分解酶的作用下，甘油三酯被逐級分解，最終以甘油和游離脂肪酸的形式進(jìn)入血液，完成脂動員過程[4]。ATGL的作用發(fā)生在脂肪動用時水解甘油三酯的第一步，為激素敏感脂肪酶(Hormone sensitive lipase，HSL)提供甘油二酯底物，是脂肪組織和其他組織中甘油三酯水解的起始步驟的限速酶[5-6]。ATGL與HSL協(xié)調(diào)作用，才能使哺乳動物脂肪組織中貯存的甘油三酯發(fā)生脂解。

microRNA(miRNA)是一類約22個核苷酸長度的單鏈非編碼RNA，它通過靶向結(jié)合靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)的特定位點從而抑制該轉(zhuǎn)錄本的翻譯，最終調(diào)節(jié)特定的生理功能[7-8]。miRNA是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)者，是揭示性狀形成分子機制的一個新靶點。

ATGL是啟動脂肪動員的一個關(guān)鍵脂肪分解酶，其表達(dá)或活性上的輕微變異均有可能影響豬背膘厚和瘦肉率，研究ATGL基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對深入研究該基因的表達(dá)調(diào)控尤為重要。而有關(guān)豬ATGL基因相關(guān)的miRNA研究，目前還未見報道。本研究利用生物信息學(xué)分析，反向預(yù)測ATGL基因靶向的豬miRNA，并通過構(gòu)建含ATGL基因3′UTR的雙熒光素酶報告載體，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)和點突變試驗篩選出負(fù)性調(diào)控ATGL基因表達(dá)的miRNA，為ATGL在脂肪代謝中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與載體

人胚腎上皮細(xì)胞系HEK 293T細(xì)胞為本實驗室保存；pMIR-REPORTTMLuciferase載體購自Ambion；pRL-TK質(zhì)粒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual-luciferase Reporter Assay System)和pGEM-T載體購自Promega；凝膠回收及質(zhì)粒抽提試劑盒均購自Axygen；Platinum Taq DNA Polymerase 和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；T4 DNA連接酶、DNA marker、限制性內(nèi)切酶SpeI和Hind III購自Fermentas；各種引物、ssc-miRNA mimics及陰性對照由Invitrogen公司合成。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測與豬ATGL基因3′UTR作用的miRNA

根據(jù)miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫公布的豬miRNA(Release 21，2014)，結(jié)合MiRanda(http://www.microrna.org/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html)、RNA22(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)和MicroInspector(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)等軟件，預(yù)測在ATGL基因3′UTR存在潛在標(biāo)靶關(guān)系的豬源miRNA，選出可能性最大的10條miRNAs作為候選miRNA進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3 報告基因載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI豬ATGL基因序列(EF648448)進(jìn)行擴增測序驗證后，合成豬ATGL基因3′UTR序列，加上SpeI/Hind III酶切位點，克隆至pMIR-LUC載體中，命名為pMIR-ATGL-3′UTR(野生型，簡寫為WT)。

靶基因雙熒光素酶突變載體的構(gòu)建主要是通過PCR的方法替換掉靶基因上的各miRNA結(jié)合位點。以pMIR-ATGL-3′UTR載體為模板，根據(jù)種子區(qū)設(shè)計突變引物(表1)，分別與ATGL基因3′UTR引物擴增得到靶基因3′UTR序列結(jié)合位點上下游片段，以上下游片段混合物作為模板，PCR擴增無結(jié)合位點的靶基因3′UTR突變序列，然后通過連接pGEM-T載體測序驗證，最后克隆至pMIR-LUC載體上，構(gòu)建ATGL靶位點突變報告載體pMIR-ATGL-MT1(簡寫為MT1)、pMIR-ATGL-MT2(MT2)和pMIR-ATGL-MT3(MT3)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶檢測

293T 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染按照lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染操作說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d接種6 孔板，每孔細(xì)胞量約5×105個，培養(yǎng)過夜后對每孔細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染9組質(zhì)粒，并設(shè)空白對照，具體試驗分組：(1)無miRNA無轉(zhuǎn)染試劑的空白對照；(2)mimic Negative Control、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(3)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(4)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(5)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(6)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(7)ssc-miR-339-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(8)ssc-miR-149 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(9)ssc-miR-1249 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(10)ssc-miR-1296-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK。將轉(zhuǎn)染完成后細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計算每個轉(zhuǎn)染3個平行樣的相對發(fā)光比率 (Relative light unit，RLU)，并計算標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間報告基因的激活程度。

表1 構(gòu)建含豬ATGL基因3′UTR突變序列的熒光素酶載體所用的突變引物

Table 1 Primers for constructing luciferase reporter gene vectors containing porcineATGLmutational 3′UTR area

引物Primer突變引物序列(5′→3′)Primersequence對應(yīng)miRNACorrespondingmiRNAMT1?RMT1?FACTGGGGGGCCCGGCCCTCAGCACACCCTGGGCAGGGCCCTGGAGAAGGCTGCTTCTCCAGGGCCCTGCCCAGGGTGTGCTGAGGGCCGGGCCCCCCAGTCssc?miR?769?3pMT2?RMT2?FGTCTCACCCCACCTCACCGGGCGGGGAGATCCCCGCCCGGTGAGGTGGGGTGAGACCCCCCCCCTCCCTssc?miR?7137?3p和ssc?miR?1343MT3?RMT3?FCAGGTGCCGCAGCCCCCGGGGCCGTCGGGGGGAAGGGGAGATGAAGCATCTCCCCTTCCCCCCGACGGCCCCGGGGGCTGCGGCACCTGCssc?miR?671?5p

下劃線和方框部分表示針對預(yù)測的不同miRNA的種子區(qū)進(jìn)行堿基互補突變后的堿基序列

Underlines and boxes indicate mutant nucleotides in primers by complementing seed sequences for different miRNA

同樣的方法對點突變試驗設(shè)計試驗分組：(1)無miRNA無轉(zhuǎn)染試劑的空白對照；(2)mimic Negative Control、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(3)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(4)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-MT1和pRL-TK；(5)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(6)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-MT2和pRL-TK；(7)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(8)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-MT2和pRL-TK；(9)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(10)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-MT3和pRL-TK。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示。統(tǒng)計學(xué)分析方法采用SAS8.0的t檢驗和GLM方差分析，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著差異。為消除試驗誤差，每個表達(dá)載體分別做3次獨立轉(zhuǎn)染，每次轉(zhuǎn)染做2個復(fù)孔，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測豬ATGL基因靶向miRNAs

本研究利用生物信息學(xué)反向預(yù)測了豬ATGL基因靶向的miRNAs。根據(jù)預(yù)測結(jié)果按照自由能最小排序，排在前10的有ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p、ssc-miR-339、ssc-miR-149、ssc-miR-1249、ssc-miR-1296-5p，均與ATGL基因3′UTR存在互補結(jié)合位點(表2)，但由于ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p和ssc-miR-339在豬ATGL基因3′UTR上的互補結(jié)合位點相同，所以這3條miRNAs中挑選ssc-miR-339-5p作為代表。因此，選取ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-339-5p、ssc-miR-149、ssc-miR-1249和ssc-miR-1296-5p這8個miRNAs作為調(diào)控豬ATGL基因的候選miRNA進(jìn)行下一步篩選。

表2 與豬ATGL基因3′UTR有互補結(jié)合位點的可能miRNAs

Table 2 Potential miRNAs targeting 3′UTR of porcineATGLgene

miRNA自由能EnergymiRNA堿基位置miRNA＿starttoend豬ATGL基因3′UTR堿基位置3′UTR＿starttoendmiRNA比對序列miRNA＿alignssc?miR?769?3p-39．742～2220～413′uuGGUUCUGGGGUCUCUAGGGUcssc?miR?1343-37．982～2176～953′cgCUCUCACGCCCGGGGUCCUcssc?miR?7137?3p-30．222～1979～1003′gggcCCUUGAGGGUCUGGUCGassc?miR?671?5p-30．22～18276～2993′ggaggucGGGGAGGUCCCGAAGGassc?miR?339?5p?-29．612～19201～2253′cacuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCCussc?miR?4334?3p?-29．612～19203～2253′cuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCssc?miR?339?-29．612～19202～2253′acuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCCussc?miR?149-28．732～2177～993′cccUCACUUCUGUGCCUCGGUCussc?miR?1249-27．82～15207～2283′acuucuucCCCCCCUUCCCGCassc?miR?1296?5p-26．522～1312～333′ccucuaccucGGUCCCGGGAUumiRNA比對模式Alignment基因比對序列Gene＿alignssc?miR?769?3p|||∶|∶|||∶|∶|∶|||||5′ctCCAGGGCCCT?GGGGTCCCAgssc?miR?1343|||||||||||||∶||∶5′gtGAG?GTG?GGGCCCCGGGGcssc?miR?7137?3p||∶∶|||∶|∶|||||5′aggtGGGGCCCCGGGGCCAGCtssc?miR?671?5p|||∶||||||||||5′tcatctcCCCTTCCCGGGCTGCCcssc?miR?339?5p?||||||||∶||∶|||||5′acttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?4334?3p?||||||||∶||∶|||||5′ttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?339?||||||||∶||∶|||||5′cttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?149∶|||∶∶|||||∶|||||5′tgaGGTGGGGCCCCGGGGCCAGcssc?miR?1249||||||∶|||||5′tgcactgaGGGGGCAGGGGCGtssc?miR?1296?5p||||||||||∶5′ccagccttctCCAGGGCCCTGg

*.ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p、ssc-miR-339預(yù)測與豬ATGL基因3′UTR有相同的互補結(jié)合模式，因此選取ssc-miR-339-5p為代表

*.ssc-miR-339-5p，ssc-miR-4334-3p and ssc-miR-339 had the same seed sequences binding to 3′UTR of porcineATGLgene，so ssc-miR-339-5p was chosen randomly for next research

2.2 豬ATGL基因3′UTR雙熒光素酶靶標(biāo)載體與突變載體的構(gòu)建

經(jīng)測序驗證后，構(gòu)建含有豬ATGL基因3′UTR序列的pMIR-ATGL-3′UTR載體，利用SpeI和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定得到451 bp的3′UTR片段及6.4 kb的pMIR-report骨架載體。同樣的方法驗證構(gòu)建好的ATGL基因3′UTR雙熒光素酶靶標(biāo)突變載體(圖1)。

2.3 miRNA對豬ATGL基因3′UTR的調(diào)控

重組載體pMIR-ATGL-3′UTR分別與8種ssc-miRNA mimics轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，同時設(shè)置無任何同源關(guān)系的miRNA作為陰性對照(NC)，36 h后用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)配對資料t檢驗，ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149對豬ATGL基因3′UTR抑制效果差異顯著，其中ssc-miR-1343+pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性較NC+pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染組降低了48.8%(P<0.01)，ssc-miR-7137-3p共轉(zhuǎn)染組降低了42.3%(P<0.01)，ssc-miR-671-5p組降低了32.8%(P<0.01)，ssc-miR-769-3p降低了19.4%(P<0.01)，ssc-miR-149組降低了9.4%(P<0.05)；而pMIR-ATGL-3′UTR 分別與ssc-miR-339-5p、ssc-miR-1249和ssc-miR-1296-5p共轉(zhuǎn)染時，其熒光比率較對照組沒有顯著差異(P>0.05)，說明這3種miRNAs對ATGL基因3′UTR無抑制作用。從最開始預(yù)測的10種miRNAs中，初步篩選出5種miRNAs(ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)可通過ATGL3′UTR靶位點降低pMIR-ATGL-3′UTR的表達(dá)。

M．DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pMIR-ATGL-3′UTR載體；2.pMIR-ATGL-MT1載體；3.pMIR-ATGL-MT2載體；4.pMIR-ATGL-MT3載體 M.DNA marker；1.pMIR-ATGL-3′UTR vector；2.pMIR-ATGL-MT1 vector；3.pMIR-ATGL-MT2 vector；4.pMIR-ATGL-MT3 vector圖1 雙酶切鑒定pMIR-ATGL-3′UTR驗證載體和突變載體Fig.1 Dual digestion of pMIR-ATGL-3′UTR vector and mutation vectors

*表示與mimic NC共轉(zhuǎn)染組比較差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；所有轉(zhuǎn)染組以海腎熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染內(nèi)參照*.P<0.05；**.P<0.01；Renilla luciferase reporter vector was used as an internal control in all transfections圖2 不同miRNA mimics分別與pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的相對熒光素酶活性Fig.2 Relative luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR reporter cotransfected with various miRNA mimics in 293T celles

為了進(jìn)一步驗證各miRNAs與ATGL3′UTR結(jié)合的靶位點，本試驗選取了抑制作用較明顯的ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p和ssc-miR-671-5p，并針對不同miRNAs對預(yù)測種子區(qū)分別進(jìn)行了反義突變(表2)。Ssc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p的靶位點結(jié)合序列鄰近，設(shè)計構(gòu)建同一個3′UTR突變體命名為pMIR-ATGL-mut2(MT2)，而ssc-miR-769-3p和ssc-miR-671-5p對應(yīng)的突變體分別命名為pMIR-ATGL-mut1(MT1)和pMIR-ATGL-mut3(MT3)。

不同ssc-miRNA與pMIR-ATGL-3′UTR(WT)或pMIR-ATGL-mut(MT)共轉(zhuǎn)染的雙熒光素酶活性差異比較見圖3和表3。與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，4種ssc-miRNAs都能顯著或極顯著地下調(diào)pMIR-ATGL-3′UTR的相對熒光素酶活性，驗證了4種miRNA都能靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，但對預(yù)測的種子區(qū)分別進(jìn)行突變后的回復(fù)效果卻不一樣。當(dāng)ssc-miR-769-3p與WT共轉(zhuǎn)染時，其相對熒光素酶活性比轉(zhuǎn)染NC+WT的對照組下降了41.6%，差異極顯著(P<0.01)，與MT1共轉(zhuǎn)染時，又回復(fù)了49.5%(P<0.05)，但與NC組仍存有顯著差異(P<0.01)，說明預(yù)測的種子區(qū)影響到了ssc-769-3p與3′UTR的結(jié)合，并對ATGL3′UTR產(chǎn)生了一定的下調(diào)效果，但效果并不是很明顯；ssc-miR-1343與WT共轉(zhuǎn)染時，其相對熒光素酶活性下降了36.3%(P<0.01)，與MT2共轉(zhuǎn)染時，又回復(fù)了87.8%(P<0.01)，與NC組差異不顯著(P>0.05)；ssc-miR-7137-3p與WT共轉(zhuǎn)染時其相對熒光素酶活性下降了23.3%(P<0.01)，與MT2共轉(zhuǎn)染時，又回復(fù)了116.4%(P<0.01)，與NC組相當(dāng)(P>0.05)；ssc-miR-671-5p與WT共轉(zhuǎn)染時，其相對熒光素酶活性下降36.9%(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染MT3時，相對熒光素酶活性卻沒有回復(fù)，與WT共轉(zhuǎn)染組沒有差異(P>0.05)，說明突變并沒有影響ssc-miR-671-5p與ATGL3′UTR其他位置的結(jié)合，且結(jié)合位點并非預(yù)測的種子區(qū)域。結(jié)果說明，ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p能通過預(yù)測的“種子區(qū)”靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

A、B、C.不同大寫字母表示差異極顯著，P<0.01。mimic NC.miRNA模擬物陰性對照；WT.無突變的pMIR-ATGL-3′UTR載體；MT.針對不同miRNA進(jìn)行種子區(qū)突變后的pMIR-ATGL-mut載體，其中與ssc-miR-769-3p對應(yīng)的是MT1載體，與ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p對應(yīng)的是MT2載體，與ssc-miR-671-5p對應(yīng)的是MT3載體。表3同Different letters denoting significant difference between groups：A，B,C.P<0.01.Mimic NC.miRNA mimic negtive control；WT.pMIR-ATGL-3′UTR vector as a wild type；MT.pMIR-ATGL-mut vectors，in which MT1 has the mutated seed sequence for ssc-miR-769-3p，MT2 has the mutated seed sequence for ssc-miR-1343and ssc-miR-7137-3p，MT3 for ssc-miR-671-5p.The same as table 3圖3 種子區(qū)突變前后4種ssc-miRNAs對熒光素酶表達(dá)的影響Fig.3 Relative luciferase activity of various reporters in the presence or absence of miRNA seed sequence in 293T cells

表3 不同ssc-miRNA與pMIR-ATGL-3′UTR(WT)或pMIR-ATGL-mut(MT)共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性差異比較

Table 3 Difference comparison of relative luciferase activity in 293T cells cotransfected between different ssc-miRNAs and corresponding reporter vectors

相對熒光素酶比值RLU均值±標(biāo)準(zhǔn)差Mean±SDP(NC?WT)1P(WT?MT)2P(NC?MT)3ssc?miR?769?3pmimic+WTssc?miR?769?3pmimic+MT116．79±0．4922．71±0．49<0．00010．00020．0001ssc?miR?1343mimic+WTssc?miR?1343mimic+MT218．32±0．5627．47±0．56<0．0001<0．00010．1673ssc?miR?7137?3pmimic+WTssc?miR?7137?3pmimic+MT222．06±0．6329．84±0．630．00030．00010．2606ssc?miR?671?5pmimic+WTssc?miR?671?5pmimic+MT318．13±0．5218．34±0．52<0．00010．7845<0．0001mimicNC28．73±0．49

1、2、3.各組間的差異比較P值1,2,3.Pvalue among various groups

3 討 論

miRNA是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)者，是揭示性狀形成分子機制的一個新靶點。到目前為止，在最新的miRBase版本(Release 21)中已發(fā)現(xiàn)的豬miRNAs有382種，明顯低于已鑒定的人(1 881種)和小鼠(1 193種)的miRNAs數(shù)量，而其中絕大多數(shù)的生物學(xué)功能尚不完全清楚。不斷積累的證據(jù)顯示，miRNA在脂肪代謝中發(fā)揮重要功能，不但調(diào)控動物脂肪的分化，還參與脂類代謝[9-11]及與脂類代謝相關(guān)的激素內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[12]。在動物體內(nèi)敲除miR-14基因，導(dǎo)致甘油三酯和甘油二酯的含量增加，過量表達(dá)則減少[9]。抑制肥胖小鼠模型中miR-122的表達(dá)除了降低血漿膽固醇水平外，會明顯促進(jìn)脂肪變性，且脂肪生成基因表達(dá)減少[11]。miR-1792通過靶位點Rb2/pl30的3′UTR作用，能加快脂肪前體細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞分化速度，增加甘油三酯的沉積[13]。對豬miRNA的研究中，李國喜[14]對7和240日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織miRNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，共篩選到227種豬保守miRNAs，同時確定miR-103參與脂類代謝和脂肪細(xì)胞分化，并提出miR-103可能通過靶作用于維甲酸誘導(dǎo)14基因(RAI14)促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化。在豬脂肪細(xì)胞分化的過程中，miR143通過作用靶點細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[15]，也能促進(jìn)甘油三酯的分解，抑制甘油和游離脂肪酸的合成，進(jìn)而促進(jìn)脂滴沉積[16]；miR-27a能抑制脂質(zhì)的合成代謝，促進(jìn)脂質(zhì)的分解代謝，進(jìn)而阻礙豬脂肪細(xì)胞脂滴的沉積[16]；豬miR-181a能通過靶位點TNFα基因的3′UTR作用，能加速脂滴聚集，增加甘油三酯的沉積，調(diào)控脂肪發(fā)生[17]。這些說明miRNA也作為脂肪代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一份子發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。脂肪的發(fā)育程度與豬瘦肉率關(guān)系密切，所以研究miRNA對脂肪代謝的調(diào)控機制意義重大。

ATGL能催化細(xì)胞內(nèi)甘油三酯降解的起始步驟，是啟動脂肪動員的一個關(guān)鍵脂肪分解酶。如果能篩選到參與調(diào)控ATGL基因表達(dá)的miRNA，并分析其調(diào)控機制，人們就可以明確這些miRNA在脂肪代謝中所扮演的角色，從而無論是明確ATGL脂解機理還是在開發(fā)潛在的飼料添加劑方面都有重要價值。S.K.Das博士利用雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)，miR-124a能通過與小鼠ATGL基因的3′UTR結(jié)合，從而下調(diào)小鼠ATGL基因 mRNA表達(dá)[18]。但由于豬和人的ATGL基因在3′UTR存在較大的差異，對豬ATGL基因miRNA的研究顯得很有必要。

通過靶標(biāo)預(yù)測軟件，獲得可能與豬ATGL基因3′UTR互作的10個候選miRNAs。但在軟件預(yù)測的基礎(chǔ)上，仍需要通過試驗的方法來驗證生物信息學(xué)預(yù)測的是否準(zhǔn)確。目前最為常用的miRNA靶位點鑒定方法是熒光素酶報告基因法。利用miRNA mimics及對照來驗證預(yù)測的10種miRNAs是否與豬ATGL基因的3′UTR段結(jié)合，發(fā)現(xiàn)5種miRNAs(ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)的共轉(zhuǎn)染組相對熒光活性比對照組顯著降低(P<0.05)。其中miR1343和miR7137-3p對ATGL3′UTR報告基因載體的相對熒光活性降低顯著，分別達(dá)到了48.8%和42.3%，而miR769-3p則只降低9.4%。有些報道中，miRNA對一些靶基因的表達(dá)量能抑制50%甚至更多[19]，這可能和miRNA與靶基因的結(jié)合程度有關(guān)，有些結(jié)合程度較高，有些結(jié)合程度較低[20]。繼續(xù)進(jìn)行靶位點突變試驗，進(jìn)一步縮小范圍檢測這些miRNA對其結(jié)合位點突變的ATGL基因3′UTR熒光素酶報告載體活性的影響，發(fā)現(xiàn)miR-1343和miR-7137-3p對ATGL的抑制作用因為種子區(qū)的突變得以回復(fù)，進(jìn)一步說明了這一作用是由于miRNA與ATGL基因3′UTR的作用而產(chǎn)生，且相應(yīng)的種子區(qū)是miR-1343和miR7137-3p與ATGL結(jié)合起關(guān)鍵作用的堿基，因此確定了ssc-miR1343和 ssc-miR-7137-3p與ATGL結(jié)合的靶位點。miR-671-5p對ATGL的抑制作用沒有因為突變得到回復(fù)，說明了miRNA-671-5p與ATGL3′UTR存在另外的結(jié)合位點而非預(yù)測的種子區(qū)。整個篩選過程也說明了生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果存在一定的假陽性率，需要進(jìn)一步的試驗驗證。

關(guān)于ssc-miR-1343和ssc-7137-3p的研究都還較少。G.Li等[21]采用Solexa測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)ssc-miR-1343在7和240日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織中表達(dá)；C.Chen等[22]采用相同的Solexa測序方法發(fā)現(xiàn)150日齡的大約克和梅山豬背部皮下脂肪組織中表達(dá)ssc-miR-1343，且通過莖環(huán)qPCR驗證了梅山豬中ssc-miR-1343的表達(dá)量比大約克豬高出一倍；最新發(fā)現(xiàn)其在乳汁中也有表達(dá)[23]。這也都說明ssc-miR-1343與豬脂肪組織的發(fā)育和脂肪代謝有著某些聯(lián)系，而本研究發(fā)現(xiàn)的ssc-miR-1343與豬ATGL3′UTR的互作模式也許能為這個聯(lián)系提供一個答案，ssc-miR-1343可能通過調(diào)控ATGL的表達(dá)進(jìn)而影響豬脂肪代謝。而對于ssc-miR-7137-3p的報道更少，其最早發(fā)現(xiàn)于豬感染胸膜肺炎放線桿菌后的肝組織中[24]，后來發(fā)現(xiàn)在豬乳汁中也有表達(dá)[23]，但還未見有關(guān)ssc-miR-7137-3p與脂肪代謝關(guān)系的報道。

由于每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因[25]。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。本研究初步篩選出2種miRNAs對豬ATGL具有較顯著的調(diào)控作用，但其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)行更深入的研究，而且還有待于進(jìn)一步檢測ssc-miRNA-1343和ssc-miR-7137-3p對豬ATGL蛋白水平的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了豬ATGL基因3′UTR的熒光素酶驗證載體和突變載體，初步篩選出與豬ATGL基因3′UTR 互作的5種miRNAs (ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)，并通過突變試驗發(fā)現(xiàn)ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p能通過預(yù)測的“種子區(qū)”靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并下調(diào)其表達(dá)，為進(jìn)一步發(fā)掘調(diào)控豬ATGL基因表達(dá)的miRNA提供了試驗基礎(chǔ)。

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(編輯 郭云雁)

Prediction and Validation of miRNA Targeting PorcineATGLGene

DAI Li-he，CHU Xiao-hong，LU Fu-zeng，HUANG Sun-ping，XU Ru-hai*

(ZhejiangEngineeringResearchCenterforLivestockandPoultryGeneticBreeding，InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

To preliminary screen out ssc-miRNAs targeting porcine adipose triglyceride lipase gene (ATGL)，10 ssc-miRNAs targetingATGLwere predicted by bioinformatics analysis．3′UTR of porcineATGLgene was inserted into the pMIR-Luc target reporter vector and transiently co-transfected with candidate miRNA mimics into HEK 293T cells，using pRL-TK vector as an internal control reporter.Three other reporter vectors containing the mutated ssc-miRNAs targeting sites by reversing the seed region of targeting sites were created as negative controls.The dual luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase．The results showed that pMIR-ATGL-3′UTR recombinant vector was successfully constructed which contained 3′UTR of porcineATGLgene.Dual luciferase reporter assay showed that ssc-miR-769-3p，ssc-miR-1343，ssc-miR-7137-3p，ssc-miR-671-5p and ssc-miR-149 could down-regulate the luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR vector in 293T cell，while mutant assay verified ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the luciferase activity by targeting the predicted seed region of 3′UTR of porcineATGLgene.These results indicated that ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the expression of porcineATGLgene by targeting its 3′UTR.

pig；ATGLgene；miRNA；dual luciferase reporter system；3′UTR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.002

2014-11-21

國家自然科學(xué)基金(31201783)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2011AA100304-1)；浙江省自然基金(Y3100569)；浙江省育種專項(2012C12906-5)

戴麗荷(1982-)，女，浙江天臺人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：dailihe505@126.com

*通信作者：徐如海，E-mail：xuruhai@163.com

S828.2

A

0366-6964(2015)08-1281-09