王 鑫，馮 波，孫向婉，李平麗，董 虹*，穆 祥*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

人參皂苷Rb1對(duì)微血管自律性舒縮活動(dòng)及大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣瞬時(shí)變化的影響

王 鑫1，馮 波2，孫向婉1，李平麗1，董 虹1*，穆 祥1*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

探討人參皂苷Rb1(GSRb1)對(duì)人合谷穴區(qū)皮內(nèi)微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅及大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RMMECs)內(nèi)游離鈣離子瞬時(shí)變化的影響。利用激光多普勒血流測(cè)定儀結(jié)合離子導(dǎo)入儀檢測(cè)微血管自律性舒縮活動(dòng)的振幅。利用激光共聚焦顯微鏡、鈣離子熒光探針Fluo-3AM檢測(cè)ATP引起的RMMECs細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化及Rb1對(duì)其的影響。結(jié)果表明：試驗(yàn)確定了能夠引起RMMECs細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子釋放的ATP的最低量為0.5 μg·mL-1，瞬時(shí)升高差異顯著的劑量是0.7 μg·mL-1，能夠影響RMMECs細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化的GSRb1的最低量為8 μg·mL-1。RMMECs經(jīng) 8 μg·mL-1GSRb1孵育后，能夠刺激細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子釋放的ATP的最低量升高為1.5 μg·mL-1。本研究說(shuō)明，提高微血管自律運(yùn)動(dòng)振幅的中藥成分GSRb1能夠通過(guò)對(duì)RMMECs胞內(nèi)鈣離子的影響，提高RMMECs對(duì)ATP的耐受能力(ATP的刺激量由0.5 μg·mL-1升高到1.5 μg·mL-1)。

微血管自律運(yùn)動(dòng)；GSRb1；ATP；Ca2+；RMMECs

微血管的自律運(yùn)動(dòng)是一種具有獨(dú)特的振幅和頻率的復(fù)雜的似周期性的生物波[1]。眾多疾病狀態(tài)下微血管自律性舒縮活動(dòng)減弱，如急性和長(zhǎng)期慢性炎癥[2-3]、糖尿病[4]、高血壓[5]和肥胖患者[6]等。有研究顯示中藥成分[7]、電針[8]、半導(dǎo)體激光[9]等刺激均可提高微血管自律性舒縮活動(dòng)的幅度，說(shuō)明提高微血管自律運(yùn)動(dòng)幅度對(duì)治療疾病具有潛在的意義。微血管自律性舒縮活動(dòng)能評(píng)估微血管內(nèi)皮的功能狀態(tài)[10]，而微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常會(huì)直接導(dǎo)致各種心血管相關(guān)疾病的產(chǎn)生。

迄今為止，中藥及其有效成分的作用機(jī)制研究大多集中在血液流變學(xué)[11-12]和對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用[13,15]方面。而本研究旨在通過(guò)研究中藥成分人參皂苷(Ginsenoside Rb1，GSRb1)對(duì)微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)外界刺激的耐受能力來(lái)探討中藥治療疾病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Fluo-3AM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen，Pluronic F-127購(gòu)自美國(guó)Invitrogen，GSRb1購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司(純度>98%)，胎牛血清、DMEM、D-Hank’s購(gòu)自美國(guó)Gibco，CD31因子兔抗鼠一抗、FITC標(biāo)記二抗購(gòu)自北京博奧森(貨號(hào)bs-0195R)，細(xì)胞培養(yǎng)6孔板購(gòu)自Costar，玻底細(xì)胞培養(yǎng)皿(底部帶有一個(gè)直徑10 mm的小坑)購(gòu)自美國(guó)Corning，L-谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma，胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ型凍干粉購(gòu)自美國(guó)GiBco公司。

1.2 微血管自律性舒縮活動(dòng)的測(cè)量

解剖學(xué)位置結(jié)合穴位定位儀找到志愿者手陽(yáng)明大腸經(jīng)上的合谷穴作為待測(cè)穴位，并標(biāo)記。用生理鹽水溶解GSRb1(終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1)，以導(dǎo)入生理鹽水(Normal saline NS)作為對(duì)照。離子導(dǎo)入儀(瑞典Perimed 公司，Milli-QA10型)將藥物導(dǎo)入穴位；激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀(瑞典Perimed 公司主機(jī)型號(hào)PeriFlux5000，探頭型號(hào)Probe481-1)測(cè)量導(dǎo)藥前后微血管血流灌注量(PU)。以PUmax-PUmin表示微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅。采用Perimed 提供的統(tǒng)計(jì)軟件，從每位自愿者導(dǎo)藥前后微血管舒縮活動(dòng)振幅圖像中分別選取5段數(shù)據(jù)計(jì)算導(dǎo)藥前后振幅平均值﹝(PUmax-PUmin)÷5﹞。

1.3 大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat myocardial microvascular endothelial cells，RMMECs)的原代培養(yǎng)及鑒定

10日齡SD大鼠，脫頸處死，取出左心室壁，剝離心內(nèi)膜和外膜，于0.2%的Ⅱ型膠原酶中剪碎，37 ℃消化20 min，終止消化過(guò)200目篩，1 500 r·min-1離心6 min，接種于6孔板內(nèi)，4 h后更換培養(yǎng)液，刮除形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)傳代。第二次傳代將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)碟底部的坑內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)20 h后進(jìn)行試驗(yàn)。形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫熒光法鑒定細(xì)胞的純度。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)；用兔抗大鼠CD31相關(guān)抗原一抗(對(duì)照不加一抗，加等量PBS)37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3次，每次3 min；加FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育45 min，PBS沖洗3次，每次3 min；PBS沖洗2次，去離子水洗1次，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 激光共聚焦測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化

先將Fluo-3AM混于Pluronic F-127(終濃度為0.02%)中，再使用不含Ca2+、Mg2+的無(wú)色D-Hank’s稀釋?zhuān)笷luo-3AM終濃度為5 μmol·mL-1。5 μmol·mL-1的Fluo-3AM裝載細(xì)胞15 min，不含Ca2+、Mg2+的D-Hank’s洗兩遍，加入含有1%胎牛血清的D-Hank’s(不含Ca2+、Mg2+、無(wú)色)繼續(xù)孵育20 min(讓細(xì)胞內(nèi)的酯酶將Fluo-3AM水解成Fluo-3)，不含Ca2+、Mg2+的D-Hank’s洗兩遍，加入Hepes緩沖液(NaCl 140 mmol·L-1，KCl 5 mmol·L-1，Hepes 10 mmol·L-1，Glucose 3 mmol·L-1，CaCl22 mmol·L-1，MgCl21 mmol·L-1，用NaOH調(diào)pH為7.4)緩沖5 min后使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，Leica Application Suite Advanced Fluorescence,40倍物鏡)檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1GSRb1對(duì)微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅的影響

經(jīng)皮將NS導(dǎo)入穴位前后微血管血流管住量變化極不顯著(圖1①)。導(dǎo)入GSRb1后，穴位區(qū)皮內(nèi)的微血管血流灌注量明顯增大(圖1②)。導(dǎo)藥后波動(dòng)的振幅明顯高于導(dǎo)藥前波動(dòng)的振幅(P<0.01)(圖1B)，其振幅變化為導(dǎo)藥前的2倍，而導(dǎo)入生理鹽水后振幅的變化不顯著。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及探針裝載

細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見(jiàn)成“鋪路石”樣生長(zhǎng)(圖2A)，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)的因子被FITC標(biāo)記的抗體標(biāo)記呈現(xiàn)清晰的綠色熒光，而細(xì)胞核因缺少CD31因子呈現(xiàn)暗色(圖2B)。因此，由形態(tài)學(xué)和CD31免疫熒光鑒定表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為RMMECs。經(jīng)5μmol·mL-1的Fluo-3AM裝載細(xì)胞15min后，可見(jiàn)Fluo-3均勻分布在細(xì)胞內(nèi)(圖2D)。

①,②分別表示導(dǎo)入NS和GSRb1，A表示導(dǎo)入之前，B表示導(dǎo)入之后；③為經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理的數(shù)據(jù)，**表示P<0.01①,② represent the introduction of NS and GSRb1。A is before the introduction，B is after the introduction；③ is statistics data ,** P<0.01圖1 GSRb1對(duì)微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅的影響Fig.1 Effect of GSRb1 on the microvascular vasomotion amplitude of self-discipline

A.倒置顯微鏡下細(xì)胞；B.倒置熒光顯微鏡下抗體標(biāo)記后的細(xì)胞；C.陰性為對(duì)照；D.5 μmol·mL-1的Fluo-3AM負(fù)載細(xì)胞15 minA.Cells under inverted microscope photos；B.Antibody marker under inverted fluorescence microscope cell images；C.As negative as control；D.The image of the 5 μmol·mL-1 Fluo-3AM load cell for 15 min 圖2 RMMECs的鑒定及探針負(fù)載Fig.2 Identification and probe of RMMECs load

2.3 GSRb1對(duì)RMMECs內(nèi)鈣的影響

2.3.1 刺激RMMECs細(xì)胞內(nèi)鈣瞬時(shí)變化的ATP和GSRb1最小劑量 0.3 μg·mL-1的ATP不能夠刺激RMMECs內(nèi)游離鈣離子瞬時(shí)升高(圖3 A)。0.5、0.6 μg·mL-1的ATP剛好能夠引起RMMECs胞內(nèi)出現(xiàn)鈣離子峰(圖3B、C)。當(dāng)質(zhì)量濃度升高到0.7 μg·mL-1時(shí)，ATP會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子顯著升高(圖3E)。Hepes緩沖液對(duì)照組結(jié)果表明Hepes緩沖液不能誘導(dǎo)RMMECs內(nèi)游離鈣離子瞬時(shí)變化(圖未展示)。因此，能夠誘導(dǎo)RMMECs胞內(nèi)鈣離子瞬時(shí)升高ATP的最低劑量為0.5 μg·mL-1，瞬時(shí)升高差異顯著的劑量是0.7 μg·mL-1。5 μg·mL-1的GSRb1對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子沒(méi)有影響(圖4A)，6、7 μg·mL-1的GSRb1剛好能夠引起RMMECs內(nèi)鈣降低(圖3E)。當(dāng)質(zhì)量濃度升高到8 μg·mL-1，GSRb1能夠顯著降低RMMECs內(nèi)鈣離子(圖3 E)。結(jié)果表明，能夠降低RMMECs內(nèi)鈣離子的GSRb1劑量為8 μg·mL-1。

A、B、C、D分別為0.3、0.5、0.6、0.7 μg·mL-1的ATP刺激RMMECs后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。開(kāi)始記錄30 s加ATP。E為經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理的數(shù)據(jù)柱狀圖,**表示P<0.01A，B，C，D are Figures that show the change of intracellular calcium by 0.3，0.5，0.6，0.7 μg·mL-1ATP after RMMECs stimulation，respectively.To start recording 30 s plus ATP.E show the statistics data，** was that P<0.01 圖3 不同劑量ATP對(duì)RMMECs內(nèi)鈣的影響Fig.3 Effect of different doses of ATP on the RMMECs of intracellular calcium

A、B、C、D分別為5、6、7、8 μg·mL-1的GSRb1對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響。開(kāi)始記錄30 s后加GSRb1。E為經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理的數(shù)據(jù)柱狀圖,**表示P<0.01A，B，C，D are the Figures that show the effects of 5，6，7，8 μg·mL-1 GSRb1 on intracellular calcium，respectively.To start recording 30 s plus GSRb1.E show the statistics data，** was that P<0.01圖4 不同劑量GSRb1對(duì)RMMECs內(nèi)鈣的影響Fig.4 Effect of different doses of GSRb1 on the RMMECs of intracellular calcium

2.3.2 GSRb1對(duì)ATP誘導(dǎo)RMMECs細(xì)胞內(nèi)鈣變化的影響 經(jīng)8 μg·mL-1GSRb1孵育細(xì)胞20 min后，相對(duì)于圖3(未經(jīng)GSRb1孵育，0.5 μg·mL-1的ATP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響)0.5 μg·mL-1的ATP不能夠誘導(dǎo)RMMECs內(nèi)鈣瞬時(shí)升高(圖5A)。當(dāng)ATP質(zhì)量濃度提高到1.5 μg·mL-1時(shí)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子顯著升高(圖5C)。經(jīng)相同摩爾濃度的組胺(舒張血管物質(zhì))孵育20 min后，用0.5 μg·mL-1的ATP刺激仍會(huì)出現(xiàn)明顯的鈣離子峰(圖5D)。

A、B、C分別為8 μg·mL-1 GSRb1孵育20 min后0.5、1、1.5 μg·mL-1 ATP刺激RMMECs內(nèi)游離鈣離子的變化；D為相同摩爾濃度組胺孵育20 min后0.5 μg·mL-1的ATP刺激RMMECs內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。開(kāi)始記錄后30 s加ATP。E為經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理的數(shù)據(jù)，**表示P<0.01A，B，C are the Figures that show the effects of 0.5，1，1.5 μg·mL-1 ATP on intracellular calcium after incubation 20 min by 8 μg·mL-1 GSRb1，respectively.D was 0.5 μg·mL-1 ATP on intracellular calcium after incubation 20 min by the same molarity histamine.E show the statistics data，** was that P<0.01圖5 GSRb1孵育RMMECs后不同劑量ATP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的作用Fig.5 The effect of different doses of ATP on intracellular calcium after incubation of RMMECs with GSRb1

3 討 論

微血管自律性的舒縮活動(dòng)參與多種生理、病理過(guò)程的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)許多生理、病理過(guò)程及疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有重要意義，故對(duì)其檢測(cè)及研究顯得尤為重要。有研究顯示提高穴位區(qū)微血管自律運(yùn)動(dòng)振幅能有效減輕原發(fā)性痛經(jīng)導(dǎo)致的疼痛[16]。因此，提高微血管自律性舒縮活動(dòng)的振幅具有潛在的治療疾病的意義。微血管舒縮活動(dòng)的研究方法主要包括體外分離微動(dòng)脈、體內(nèi)顯微觀察和體表多普勒血流信號(hào)采集[17]等。體外分離出微動(dòng)脈可直接測(cè)量微動(dòng)脈管徑的周期性變化[18]，但是，該方法不能完全真實(shí)反映出體內(nèi)的變化規(guī)律，因而在研究中受到限制。而本試驗(yàn)采用的激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀可以在體表檢測(cè)到皮膚0.5～1 mm范圍內(nèi)下微血管網(wǎng)血流量的變化，因此在無(wú)損傷狀態(tài)下可反映出微血管舒縮活動(dòng)，并且利用離子導(dǎo)入儀，將藥物在無(wú)損傷性的微小電流作用下，導(dǎo)入皮下組織，選用生理鹽水配制所用中藥有效成分，保證導(dǎo)入后能夠反映藥物作用的真實(shí)性。另外試驗(yàn)中所選用的中藥成分均來(lái)自天然植物，用量極微，只作用于局部皮膚，對(duì)組織不造成損傷。采用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀結(jié)合離子導(dǎo)入儀的方法可準(zhǔn)確有效地研究生理?xiàng)l件下中藥有效成分對(duì)微血管舒縮活動(dòng)的影響。使用這一研究方法發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入GSRb1能夠顯著增加穴位區(qū)皮內(nèi)微血管血流灌注量最大值與最小值之差(PUmax-PUmin)，即提高了微血管自律性舒縮活動(dòng)的振幅。

研究表明，激光掃描共焦顯微鏡和Fluo-3AM常用于檢測(cè)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的變化[19,20]。本研究中，作者使用激光掃描共焦顯微鏡及Fluo-3AM檢測(cè)RMMECs內(nèi)鈣離子的變化。內(nèi)皮細(xì)胞膜表面存在一種受體門(mén)控性陽(yáng)離子通道(purinergic ligand-gated receptor channel，P2X)，ATP是該通道配體[21]，在細(xì)胞外液中有鈣和無(wú)鈣時(shí)，ATP均能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鈣離子峰[22]，因此選擇ATP作為刺激物。可以將刺激RMMECs內(nèi)鈣產(chǎn)生變化的ATP最低劑量作為細(xì)胞對(duì)ATP的最低耐受值。能夠誘導(dǎo)RMMECs內(nèi)鈣離子瞬時(shí)升高的ATP最低劑量為0.5 μg·mL-1，瞬時(shí)升高差異顯著的劑量是0.7 μg·mL-1，GSRb1能夠降低RMMECs內(nèi)游離鈣離子的濃度，最低劑量為8 μg·mL-1。經(jīng)8 μg·mL-1GSRb1孵育RMMECs后，0.5 μg·mL-1ATP刺激細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)鈣離子沒(méi)有任何變化，1.0 μg·mL-1ATP刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子雖然有升高，但是沒(méi)有差異顯著，1.5 μg·mL-1ATP刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高有顯著差異。表明GSRb1對(duì)胞外ATP誘導(dǎo)的RMMECs內(nèi)游離鈣離子瞬時(shí)升高有明顯的抑制作用。研究顯示，GSRb1對(duì)心肌細(xì)胞膜Ca2+電流有明顯的阻滯作用，是一種鈣通道阻滯劑[22]，人參總提取物對(duì)大鼠感覺(jué)神經(jīng)元高電壓激活的鈣離子通道具有抑制作用，能抑制高電壓激活鈣離子通道的電流[23]，對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元上的L-型鈣離子通道也有抑制作用[24]。而將ATP的劑量提高至1.5 μg·mL-1時(shí)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬時(shí)升高。使用只具有血管舒張作用組胺孵育RMMECs后，0.5 μg·mL-1ATP仍然能使RMMECs內(nèi)鈣離子瞬時(shí)變化，說(shuō)明GSRb1不是單純的通過(guò)提高血管舒縮幅度，還有可能夠通過(guò)抑制RMMECs上鈣離子通道降低細(xì)胞對(duì)ATP的敏感度。

采用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀結(jié)合離子導(dǎo)入儀，檢測(cè)出GSRb1能夠顯著提高微血管舒縮活動(dòng)振幅；使用激光掃描共焦顯微鏡和Fluo-3AM檢測(cè)出GSRb1能提高RMMECs對(duì)ATP的耐受能力。推測(cè)提高微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)胞外刺激的耐受能力可能是具有提高微血管自律性舒縮活動(dòng)振幅的中藥成分防治疾病的機(jī)制。

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(編輯 白永平)

Effect of Ginsenoside Rb1 Induce Microvascular Vasomotion and the Effect on Sensitive Threshold of Rat Myocardial Microvascular Endothelial Cells

WANG Xin1，F(xiàn)ENG Bo2，SUN Xiang-wan1，LI Ping-li1，DONG Hong1*，MU Xiang1*

(1.BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversityofAgriculture，Beijing102206，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The aim of this study was to investigate the effects of Ginsenoside Rb1(GSRb1) induce Hegu acupoint microvascular vasomotion and the effect on sensitive threshold of Rat myocardial microvascular endothelial cells(RMMECs).Microvascular vasomotion was detected by laser doppler blood flow monitor combined with iontophoresis device.The changes of calcium in the RMMECs were measured by laser scanning confocal microscopy combined with calcium fluorescent probe (Fluo-3AM).The results were as follows：The minimum amount of ATP could induce calcium transient increase in RMMECs was 0.5 μg·mL-1，the dose of significant difference was 0.7 μg·mL-1and the minimum amounts of GSRb1 inducing calcium changes in RMMECs was 8 μg·mL-1.After incubation 8 μg·mL-1of GSRb1，the minimum amount of ATP could induce calcium transient increase in RMMECs was 1.5 μg·mL-1.Eight μg·mL-1of GSRb1 can inhibit the ATP-induced intracellular calcium transient rise，that meant，GSRb1 increased the sensitive threshold of RMMECs to ATP.

microvascular vasomotion; GSRb1；ATP；Ca2+；RMMECs

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.020

2014-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101850)；北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201110020021)；北京市教委科技面上項(xiàng)目(KM201210020008)；北京市自然基金(6132007)；北京市科技新星(Z141105001814041)；2014年北京農(nóng)學(xué)院學(xué)位與研究生教育改革與發(fā)展項(xiàng)目(2014YJS057)

王 鑫(1992-)，男，江西靖安人，碩士生，主要從事中獸醫(yī)藥及疾病防控方面研究，E-mail：williamxin0217@163.com

*通信作者：董 虹，副教授，Tel：010-80799480，E-mail：donghong523@163.com; 穆 祥，教授，Tel：010-80789515，E-mail：muxiang1109@sina.com

R285.5；R331.3

A

0366-6964(2015)01-0156-07