西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科(西安710004)

惠文濤 馬小斌△ 昝 瑛 馬一楠

△通訊作者

丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的作用及其機(jī)制研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科(西安710004)

惠文濤 馬小斌△昝 瑛 馬一楠

目的：研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)雌激素受體(ER)、表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER-2)表達(dá)不同的人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)的作用，并探討其作用機(jī)制。方法：以0.025～0.8μg/ml不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉處理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞，MTT法測(cè)定不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。結(jié)果：丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后，MCF-7細(xì)胞增殖活性降低，凋亡指數(shù)升高，細(xì)胞周期分布改變，G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少；SKBR-3和MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期無(wú)明顯改變。結(jié)論：丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用,其作用機(jī)制可能與凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期阻滯有關(guān)；丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)ER陰性、HER-2陽(yáng)性和ER陰性、HER-2陰性乳腺癌細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用。

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的有效脂溶性成分[1]，丹參酮ⅡA磺酸鈉是其溶于水的劑型。研究表明，丹參酮ⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷和促進(jìn)凋亡作用[2-3]。有報(bào)道丹參酮ⅡA對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制的作用[4],但其作用機(jī)制,及對(duì)ER、HER-2表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞作用差異尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MCF-7、SKBR-3和MDA-MB-231細(xì)胞株的增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的影響，探討丹參酮ⅡA對(duì)人ER、HER-2表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞的作用及可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要材料和試劑 MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞株，購(gòu)自西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù),DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó) Hyclone公司)，PBS粉劑(京中杉生物有限公司)，胎牛血清(美國(guó) Hyclone公司)，胰酶粉劑(美國(guó) Hyclone公司)，EDTA粉劑(美國(guó) Hyclone公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó) Sigma公司)，二甲基亞砜DMSO(美國(guó) Sigma公司),碘化丙啶(Propidiumiodide, PI) (美國(guó) Sigma公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(珠海健康元生物醫(yī)藥公司)。丹參酮ⅡA磺酸鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司)，使用時(shí)用含血清的培養(yǎng)基配置至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231用含10%滅活小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃、50ml/L CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80%～90%匯合時(shí)，用含有0.04%EDTA的胰酶消化，以1∶1傳代，48 h換液，2～3d再次傳代，細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、臺(tái)盼藍(lán)染色后在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，確保活細(xì)胞在97%以上。調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔1×105個(gè)/ml(每孔100 μl)，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，并分實(shí)驗(yàn)組、培養(yǎng)基對(duì)照組、DMSO對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。次日更換培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別更換為含0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養(yǎng)基，培養(yǎng)板放回孵箱培養(yǎng)72 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT (5mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出上清液，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，在平板搖床搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處每孔的吸光度(A值)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種于6孔板中。次日起更換為含0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養(yǎng)基，72h后離心收集細(xì)胞。按AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供的方法進(jìn)行染色，取5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液1ml，離心后加入500μl的1×Banding Buffer，再依次加入5μl Annexin V-FITC，10μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種于6孔板中。次日起更換為含0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養(yǎng)基，72h后離心收集細(xì)胞。取5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液2ml，離心后棄去上清液，PBS洗滌2次×10min，用遇冷的75%酒精固定，4℃過(guò)夜；離心棄去酒精，PBS洗滌2次×5min；加PI染液100μl，4℃避光染色30min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，采用單樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)均值的大小，采用方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組數(shù)據(jù)兩兩之間的比較分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法測(cè)定丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT法測(cè)定不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉作用于乳腺癌MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞72h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.1 不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MCF-7細(xì)胞抑瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.034，P>0.05)；不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)SKBR-3細(xì)胞抑瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.098，P>0.05)；不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.068，P>0.05)。

1.2 0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MCF-7細(xì)胞抑瘤率為0.1037±0.0287，明顯大于0(t=10.848，P<0.01)；0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)SKBR-3細(xì)胞抑瘤率為0.0291±0.0727，與0相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.202，P>0.05)；0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)SKBR-3細(xì)胞抑瘤率為0.0034±0.0524，與0相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.198，P>0.05)。

圖1 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳腺癌細(xì)胞增值抑制作用

2 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉處理72h后，MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為5.16%，與對(duì)照組(1.33%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SKBR-3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為2.64%，與對(duì)照組(2.51%)相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為3.98%，與對(duì)照組(3.84%)相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

3 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響 0.8μg/ml丹參酮ⅡA處理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞72 h后,MCF-7細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加,S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SKBR-3、MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

目前乳腺癌的治療是以手術(shù)為主，輔以化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等的綜合治療。并且ER、PR、HER-2表達(dá)不同的乳腺癌預(yù)后及對(duì)化療藥物的敏感性不同[5-6]。中藥作為中國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥，是乳腺癌治療的另一個(gè)手段，具有副作用少、容易耐受的特點(diǎn)，適合作為乳腺癌患者，尤其是不能耐受化療的晚期乳腺癌患者的輔助治療[7]。丹參酮ⅡA是從中藥丹參根部提取的脂溶性有效成分,既往研究表明丹參酮ⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用和凋亡誘導(dǎo)作用,具有抑制人ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，但其作用機(jī)制及對(duì)ER陰性和HER-2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞的作用尚不清楚。

本研究用丹參酮ⅡA磺酸鈉處理ER、PR、HER-2表達(dá)不同的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)，檢測(cè)其抑制作用。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，0.025～0.8μg/ml濃度的抑瘤率大小無(wú)明顯差異，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)KBR-3、MDA-MB-231的作用微弱，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌具有抑制作用；對(duì)ER陰性、HER-2陽(yáng)性和ER陰性、HER-2陰性的乳腺癌無(wú)明顯抑制作用。丹參酮ⅡA磺酸鈉處理MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率升高，G0/G1期細(xì)胞比例增加，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用可能與誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯有關(guān)[9]。

劉永惠等[10]報(bào)道，經(jīng)蛋白酶聯(lián)免疫法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丹參酮能有效抑制突變型P53和mdm2的表達(dá)，證實(shí)了其在抑制腫瘤生產(chǎn)、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。CyclinD1 為細(xì)胞周期G1/ S 期的調(diào)控點(diǎn), 其過(guò)表達(dá)能縮短G1期, 促使細(xì)胞提前進(jìn)入S 期, 引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控、轉(zhuǎn)化和癌變[10],丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)人ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用,其作用機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。對(duì)ER陰性、HER-2陽(yáng)性和ER陰性、HER-2陰性的乳腺癌無(wú)明顯抑制作用，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過(guò)雌激素受體發(fā)揮作用，而對(duì)雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞未能發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)僅是觀察到了這一現(xiàn)象，進(jìn)一步的分子機(jī)制及其與細(xì)胞周期的關(guān)系需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 郝文慧，趙文文，陳修平.丹參酮類抗腫瘤作用與機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014 ,30( 8) : 1041-1044.

[2] Chen J，Shi DY，Liu SL，etal． Tanshinone ⅡA induces growth inhibition and apoptosis in gastric cancer in vitro and in vivo[J]．Oncol Rep，2012，27( 2) : 523-8．

[3] Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，etal． Research on the inhibitoryeffect tanshinone ⅡA on breast cancer cell proliferation[J]． Chin Pharmacol Bull， 2010，26( 7) : 903-6．

[4] Xu Changliang,Xi Tao, Anti-migration and anti-angiogenic effects of tanshiononenIIA on breast cancer cell MDA-MB-435[J].Journal of Crmaceutical University, 2009,40(6):565-570.

[5] 陳 曦，吳晶晶，張 妍，等.三陰性乳腺癌臨床病理特征及與藥物敏感度蛋白的相關(guān)性[J].腫瘤防治研究,2014,41(5)：439-442.

[6] 張曉麗,邵雪輝,楊翠軍,等.常用乳腺癌化療方案與ER、PR及C-erbB-2表達(dá)的相關(guān)性[J].江蘇醫(yī)藥,2012，37(4)：424-426.

[7] 孫 飛，潘迎英，包玉花,等.中藥湯劑聯(lián)合化療治療乳腺癌臨床療效系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,16(7):156-159.

[8] 趙丕文,牛建昭,王繼峰,等.丹參酮ⅡA抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010,26(7):903-906.

[9] 王愛(ài)紅，王明全，龐秋霞,等.番茄紅素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期和增殖的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008,37(11):1482-1484.

[10] 劉永惠，郭少賢，常 靖,等.丹參酮對(duì)血瘀證乳腺癌P53基因、mdm2基因表達(dá)的影響[J].陜西中醫(yī)，2011,32(12):1666-1667.

(收稿：2015-03-03)

Growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism

Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Hui Wentao Ma Xiaobin Zan Ying et al

Objective:To investigate the growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism.Methods :MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231 cells were cultured with different concentration (0.025～0.8μmol/L) of tanshinoneⅡA in vitro. MTT assay was used for analyzing the growth inhibitory effect of tanshinoneⅡA in human breast cancer cell lines. The apoptosis rate and cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Results:TanshinoneⅡA could inhibit effectively MCF-7 cells . Flow cytometric analysis showed apoptosis ratio of MCF-7 rised, G0/G1 phase cell populations increase ,and S，G2/M phase cell populations decrease in 0.8μmol/L concentrations of tanshinoneⅡA group after 72h．TanshinoneⅡA could not inhibit effectively SKBR-3、MDA-MB-231 cells．Conclusions:TanshinoneⅡA could inhibit effectively human breast cancer cell with estrogen receptor positive. The mechanism for the effect may be associated with induction of apoptosis and cell cycle arrest. TanshinoneⅡA can not inhibit Human Breast Cancer Cell with Estrogen Receptor Negative.

TanshinoneⅡA Breast neoplasms/immunology Receptors,Estrogen Receptors,Epidermal growth factor

丹參酮IIA 乳腺腫瘤/免疫學(xué) 受體，雌激素 受體，表皮生長(zhǎng)因子

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.004