許 明， 楊志堅(jiān)， 鄭金貴

(福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

藤茶葉片總RNA的提取及苯丙氨酸解氨酶基因(pal)片段的克隆

許 明， 楊志堅(jiān)， 鄭金貴

(福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

藤茶葉片富含多酚、多糖以及黃酮類化合物，嚴(yán)重干擾了其總RNA的提取。實(shí)驗(yàn)在裂解前先用70%丙酮對(duì)藤茶葉片冷凍研磨材料進(jìn)行多次抽提，然后采用試劑盒提取法、Trizol法和異硫氰酸胍法提取總RNA。結(jié)果表明，經(jīng)丙酮預(yù)處理后，上述3種方法均能從藤茶葉片中成功提取到高質(zhì)量的RNA，其完整性好，純度高，D260 nm/D280 nm值介于1.8～2.0之間，產(chǎn)率為22.74～33.66 μg/g。以提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，克隆到一條長(zhǎng)度為817 bp的pal片段。經(jīng)Blast比對(duì)分析，該基因片段與葡萄、茶樹等物種的pal之間具有較高的同源性。

藤茶；葉片；總RNA提??；PAL

藤茶學(xué)名為顯齒蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataW.T.Wan)，是中國(guó)特有的一種茶藥兩用植物資源，主要分布于湖北、湖南、廣西、江西、福建、貴州等地[1]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、降血壓、降血糖、保肝護(hù)肝及增強(qiáng)免疫力等多種功效[2-4]。研究表明，藤茶的有效活性成分主要是黃酮類化合物，其莖葉中的總黃酮含量高達(dá)40%左右[5-9]，含量之高在植物界十分罕見。除此之外，藤茶還富含多糖、多酚、氨基酸、維生素等多種有效成分[9]。因此，藤茶可作為一種集營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用功能為一體的天然植物資源加以開發(fā)利用。

目前關(guān)于藤茶黃酮類化合物的提取檢測(cè)及藥理功能有較多研究報(bào)道[10]，但在分子生物學(xué)方面僅有少量研究[11]。黃酮類化合物是經(jīng)苯丙氨酸代謝途徑(phenylpropanoid pathway)合成的[12]，該途徑的第一個(gè)反應(yīng)是苯丙氨酸解氨酶( PAL,EC 4.3.1.5)催化苯丙氨酸生成肉桂酸，苯丙氨酸解氨酶被認(rèn)為是黃酮類物質(zhì)生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶[13]。迄今已有大量植物的pal被鑒定和分離(僅在GenBank上登錄的就有1000多條)，但關(guān)于藤茶pal的研究尚未見報(bào)道。高質(zhì)量RNA的提取是順利開展基因克隆等分子生物學(xué)研究的重要前提，由于藤茶富含多酚、多糖及黃酮等化合物，嚴(yán)重干擾了其總RNA的提取，一些常規(guī)方法及試劑盒都不能有效地提取出藤茶葉片總RNA。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上[14-17]，先利用丙酮預(yù)處理來(lái)去除多糖、多酚等物質(zhì)，再采用試劑盒提取法、Trizol法和異硫氰酸胍法進(jìn)行提取，成功從藤茶葉片分離到高質(zhì)量的總RNA，并以其反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，克隆出藤茶苯丙氨酸解氨酸的基因片段，為后續(xù)開展藤茶黃酮類化合物的合成與代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的藤茶引自福建尤溪縣下村林場(chǎng)，移栽于福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)基地種植。取其幼葉作為RNA提取材料。

Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(RN38)和膠回收試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；DEPC(Amresco)和異硫氰酸胍(Amresco)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司；Prime Script RT-PCR Kit、DNA marker及pMD18-T載體購(gòu)于Takara公司。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)所用的研缽、藥勺、量筒等與實(shí)驗(yàn)材料有接觸的器皿用鋁箔紙包裹，于180℃烘烤2h后備用；各種槍頭、離心管用0.1%的DEPC水浸泡過夜，再高壓滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

取0.2 g新鮮的葉片材料置于預(yù)冷的研缽中，加少量PVP，用液氮快速研磨成粉末，分裝于兩個(gè)預(yù)先裝有1 mL冰冷70%丙酮的1.5 mL離心管中，溫和震蕩，8000 r/min，4℃離心10 min，去上清液，重復(fù)抽提3次。然后分別采用試劑盒提取法、Trizol和異硫氰酸胍法進(jìn)行RNA提取。其中試劑盒提取法和Trizol法的操作步驟按照廠商提供的操作說明書進(jìn)行。異硫氰酸胍法參考李志能等[18]的方法進(jìn)行操作并略有改進(jìn)，具體步驟如下：1)在上述丙酮抽提后的樣品中加入預(yù)冷的500 μL異硫氰酸胍buffer(0.75 mol/L檸檬酸鈉pH值7.0,10%十二烷基肌氨酸,4.0 mol/L異硫氰酸胍,2%PVP)，輕輕搖動(dòng)離心管使混合均勻。2)依次加入0.4 mol/L NaAc 0.5 mL、水飽和苯酚5 mL、氯仿/異戊醇1 mL，混合均勻，冰浴15 min。3)4℃條件下12000 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移上層水相至另一離心管，加入等體積的異丙醇，-20℃放置1 h。4)4℃條件下12000 r/min離心25 min，去上清，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于30 μL體積的DEPC水中。

1.2.2 RNA檢測(cè)

用U2000紫外分光光度計(jì)測(cè)D260 nm和D280 nm，并計(jì)算它們的比值以分析RNA的純度。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

RNA產(chǎn)率=D260 nm×N(稀釋倍數(shù))×40 mg/L×V(體積)/樣品質(zhì)量(g)[17]

1.2.3pal片段的克隆

采用Takara公司的Prime Script RT-PCR Kit合成第一鏈cDNA。在GeneBank中檢索其他植物的pal序列信息，用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)同源性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PALRT-1(5′-GGCACVRTCACYGCCTCCGG-3′)和PALRT-2(5′-TCTCCTCCAAATGCCTCAARTC-3′)。以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的10倍稀釋液1 μL，上下游引物(10 μmol/L )各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，EXTaq酶1 μL，dNTP (10mmol/L each) 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；94 ℃變性45 s, 56℃退火40 s, 72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α。選取PCR陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站上通過BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量分析

藤茶葉片先經(jīng)過70%的冷丙酮抽提處理后，再分別采用試劑盒提取法、Trizol法和異硫氰酸胍法對(duì)其總RNA進(jìn)行提取和分析，結(jié)果如表1和圖1所示。從表1可以看出，3種方法提取的RNA的D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之間，表明所提取RNA的純度均較好。其中試劑盒提取的RNA的D260 nm/D280 nm達(dá)到1.927，是3種方法中最高的，說明該法提取的RNA純度最好。從RNA產(chǎn)率上看，Trizol法的RNA產(chǎn)率最高，為33.66 μg/g FW，異硫氰酸胍法次之，為27.60 μg/g FW，試劑盒提取法最低，為22.74 μg/g FW。在RNA完整性方面，3種提取方法獲得的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，均可見明顯的28S和18S兩條帶(圖1)，未見明顯降解和DNA污染。由此可見，先用70%丙酮對(duì)藤茶葉片預(yù)處理后，上述3種方法均可以提取到高質(zhì)量的RNA。

表1 3種方法提取藤茶葉片總RNA的D(入)值及產(chǎn)率

1—丙酮預(yù)處理+RNA提取試劑盒; 2—丙酮預(yù)處理+Trizol法； 3—丙酮預(yù)處理+異硫氰酸胍法。

圖1 3種方法提取藤茶葉片總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig 1 Electrophoresis result of total RNA extracted with three methods fromAmpelopsisgrossedentataleaves.

M—DL2000 DNA Marker； 1—pal片段。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

Fig 2 RT-PCR amplified products separated on 1% agarose gel

2.2 藤茶pal保守區(qū)段的克隆與序列分析

以試劑盒提取的藤茶葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物PALRT1和PALRT2進(jìn)行藤茶pal片段的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果在750 bp和1000 bp之間出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序，該片段長(zhǎng)度為817 bp，推導(dǎo)編碼272個(gè)氨基酸(圖3)。將獲得片段序列提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與葡萄(Vitisvinifera)、茶樹(Camelliasinensis)、香蕉(Musaacuminata)、荔枝(Litchichinensis)、紅麻(Hibiscuscannabinus)、李(Prunussalicina)、桔梗 (Platycodongrandiflorus)、土肉桂(Cinnamomumosmophloeum)、小油桐(Jatrophacurcas)和咖啡(Coffeacanephora)等物種pal的核苷酸序列同源性高達(dá)77%以上，推導(dǎo)的氨基酸序列與這些物種的同源性則高達(dá)90%以上(表2)，推測(cè)它是pal的一個(gè)片段。

圖3 藤茶pal片段核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

pal來(lái)源GenBank登錄號(hào)核苷酸同源性(%)氨基酸同源性(%)葡萄VitisviniferaEF19246918895茶樹CamelliasinensisD2659618194香蕉MusaacuminataEU10468018194荔枝LitchichinensisFJ94401818193紅麻HibiscuscannabinusJQ77902218193李PrunussalicinaJQ35280418093桔梗PlatycodongrandiflorusJN39274918092土肉桂CinnamomumsmophloeumJF81102917990小油桐JatrophacurcasDQ88380517894咖啡CoffeacanephoraJN42034517793

3 討論

一些植物由于未能有效地分離純化其組織中的RNA，阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展。一般認(rèn)為在這些植物組織中，含有較多酚類化合物、多糖以及次生代謝產(chǎn)物，或RNase的活性較高。在完整的細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)在空間上與核酸是分離的，但當(dāng)組織被研磨，細(xì)胞破碎后，這些物質(zhì)就會(huì)與RNA相互作用，從而增加了RNA提取的難度[19]。我們前期采用一些常規(guī)的植物RNA提取方法(例如Trizol法、異巰氰酸胍法)和試劑盒都無(wú)法提取到藤茶葉片總RNA，這可能是由于藤茶葉片中含有非常豐富的黃酮、多酚和多糖類化合物造成的。比如，在使用常規(guī)Trizol法進(jìn)行提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)異丙醇沉淀后可以看到一些褐色沉淀，卻很難溶解于DEPC水中，電泳檢測(cè)也沒有觀察到條帶，推測(cè)這些沉淀可能為多酚類物質(zhì)氧化后再與RNA結(jié)合形成的不溶性復(fù)合物。而采用試劑盒進(jìn)行提取時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱膜表面會(huì)積聚一層褐色粘稠物，造成RNA難以洗脫，既使有少量溶液被洗脫下來(lái)，但也檢測(cè)不到RNA。因此，在保證RNA不被降解的前提下，能否有效去除藤茶葉片中大量存在的黃酮、多酚和多糖類化合物，是順利提取高質(zhì)量藤茶葉片總RNA的關(guān)鍵。

許多研究表明，在進(jìn)行RNA提取之前先用70%丙酮抽提可以有效的去除多糖、多酚以及色素等物質(zhì)，減少其對(duì)RNA干擾的機(jī)會(huì)。Schneiderbauer等[14]用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。肖潔凝等[15]在提取富含多糖和次生物質(zhì)的芒果子葉總RNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)70%丙酮處理，RNA質(zhì)量和得率明顯優(yōu)于未經(jīng)70%丙酮處理。周波等[16]在提取草莓果實(shí)RNA時(shí)也發(fā)現(xiàn)用冷的丙酮能有效去除類黃酮類色素的干擾。張玲等[17]用70%丙酮和80%乙醇對(duì)富含多糖、蛋白質(zhì)、多酚等次生代謝產(chǎn)物的枇杷果實(shí)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合CTAB-LiCl法得到高質(zhì)量的RNA。鑒于前人的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在藤茶葉片組織裂解前先用70%的冷丙酮預(yù)處理再進(jìn)行RNA提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)之前嘗試失敗的3種RNA提取方法(試劑盒提取法、Trizol法和異硫氰酸胍法)均能夠從藤茶葉片中獲得高質(zhì)量的RNA。

苯丙氨酸解氨酶(PAL) 是黃酮類生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，分離克隆pal對(duì)研究黃酮類物質(zhì)的代謝調(diào)控具有重要意義[20]。本研究根據(jù)GenBank已登錄的植物pal保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，用上述方法提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，克隆得到一條817 bp的基因片段，其核苷酸和氨基酸序列與其他物種具有較高的同源性，推測(cè)它是pal的一個(gè)片段。下一步計(jì)劃采用RACE技術(shù)獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析，以期為探明藤茶高黃酮含量形成的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。

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Extraction of total RNA from leaves ofAmpelopsisgrossedentataand cloning of phenylalanine ammonia lyase gene fragment

XU Ming， YAN Zhi-jian， ZHENG Jin-gui

(College of Crop Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The leaves ofAmpelopsisgrossedentataare rich of flavones, polyphenols and polymeric carbohydrateds, which hinder the iso lation of RNA. The total RNA with good integrity and high purtity can be extracted from the leaves treated with 70% acetone before lysis by the three methods of RNA Extract Kit, Trizol and Guandine thiocyanate. The values of D260 nm/D280 nmof the extracted RNA were between 1.8 to 2.0, the yields were between 22.74-33.66 μg/g FW. A 817 bp phenylalanine ammonia lyase (pal) fragment was successfully amplified from cDNAs reverse-transcribed from the total RNA. By homology analysis，the clonedpalfragment inAmpelopsisgrossedentatais highly identical to the corresponding genes invitisviniferaandcamelliasinensis.

Ampelopsisgrossedentata； leaf； isolation of total RNA；PAL

2014-06-16；

2014-09-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD01B05)；福建省自然科學(xué)基金(2012J01090)；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(ptjh12015)

許明，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ?，E-mail：xmfau@163.com；

鄭金貴，教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)生物技術(shù)，E-mail：jgzheng@fafu.edu.cn。

Q943.2

B

2095-1736(2015)02-0096-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.096