炎癥復合體的激活及調(diào)控研究進展

周 洋，楊利峰，尹曉敏，趙德明，張仲秋，周向梅＊

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193；2.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，北京100125）

天然免疫系統(tǒng)是機體防御的第一道防線，是一個復雜的系統(tǒng)。它包含一系列的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR），識別入侵機體的病原相關(guān)分子模式（pattern recognition receptors，PAMP）和宿主衍生的危險相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）。PRR由巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、上皮細胞、中性粒細胞及獲得性免疫的一些細胞表達。目前已發(fā)現(xiàn)的PRR有結(jié)合在膜上的、識別胞外環(huán)境和核內(nèi)體囊泡PAMP的Toll樣受體（Toll-like receptors）和 C型凝集素受體（C-type lectin receptors），以及識別胞內(nèi)核酸的RIG樣解旋酶（RIG like helicases）、RIG-1、MDA5、AIM2和 DAI［1］。

炎癥復合體作為其中一個重要的組成部分發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Martinon于2002年發(fā)現(xiàn)NALP1和銜接子ASC結(jié)合促炎性的caspase結(jié)合形成多組分復合物，命名為炎癥復合體，組裝形成后的炎癥復合體促進caspase激活，切割促炎因子IL-1β和IL-18前體成為活性形式，并釋放到體外［2］。局部或全身IL-1β升高可引起人類多種遺傳性或獲得性疾病，如自體免疫性疾病，也稱為cryopyrin相關(guān)周期性綜合征（cryopyrin-associated periodic syndromes，CAPS），因此對炎癥復合體的研究，尤其是激活模式，在過去的20多年非?；钴S。

1 炎癥復合體的組裝

組成炎癥復合體的成分包括受體和促炎性的caspase家族成員，多數(shù)炎癥復合體需要銜接子ASC介導組裝。炎癥復合體的名稱按照受體分子命名。

1.1 Nod樣受體及其炎癥復合體的組裝

Nod樣受體（Nod-like receptor，NLR）有 NLRP1、NLRP3、NLRP4、NLRP7和 NLRC4等，包含3個結(jié)構(gòu)域，即C-端的富含亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）、中間的核苷酸結(jié)合寡聚化區(qū)域（nucleotide-binding and oligomerization，NACHT）、N-端的 pyrin 結(jié)構(gòu)域（PYD）或者caspase-1激活和募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domains，CARD），N-端的結(jié)構(gòu)域部分決定NLR的命名，如NLRP3的N-端結(jié)構(gòu)域是PYD，而NLRC4的N-端結(jié)構(gòu)域是CARD。LRR的功能目前尚不清楚，一般認為是炎癥復合體激活必需的結(jié)構(gòu)域，NLRP7的LRR截去LRR后不能與ASC互作，而截去PYD不影響二者的結(jié)合［3］。NLRP3ΔLRR Z／ΔLRR Z小鼠氣囊模型注射尿酸鈉晶體，白細胞浸潤的數(shù)目顯著減少，敲除鼠分離的骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）與尿酸鈉孵育后caspase-1的激活以及IL-1β的釋放受到抑制。但也有研究表明LRR使受體蛋白處于滅活狀態(tài)，細胞受到外界刺激后，識別并結(jié)合配體，繼而引起受體蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，激活下游通路。NLRP1蛋白截去LRR后不需要活化因子MDP即可結(jié)合FITC-ATP。外源的LRR對炎癥復合體的激活同樣也有抑制作用。有的細菌借助自身表達含LRR的蛋白逃避宿主的免疫。耶爾森菌屬的YopM是一個含LRR的效應(yīng)子，假結(jié)核耶爾森菌Kim菌株對宿主caspase-1的激活有抑制作用，截去YopM的6個～15個LRR后喪失對IL-1β分泌的抑制作用［4］。NACHT是受體結(jié)合配體后活化發(fā)生自身寡聚化結(jié)合的部位。CARD募集并結(jié)合caspase-1，PYD屬于信號傳導模塊的死亡結(jié)構(gòu)域超家族，通過與ASC的PYD同型蛋白互作募集ASC。

NLRP3、NLRP4和NLRP7識別PAMP或DAMP后發(fā)生自身寡聚化，通過PYD與ASC的PYD互作，ASC通過CARD結(jié)構(gòu)域募集procaspase-1，并誘導procaspase-1活化形成有活性的p10／p20四聚體，切割pro-IL-1β和pro-IL-18成活性形式，釋放到細胞外［3］。NLRC4和NLRP1不需要結(jié)合ASC，通過CARD結(jié)構(gòu)域直接募集并活化procaspase-1，但通過NLRC4炎癥復合體最大程度激活caspase-1卻需要ASC。

1.2 AIM2和IFI16及其炎癥復合體的組裝

AIM2、IFI16識別胞漿內(nèi)的DNA。AIM2和IFI16屬于HIN-200蛋白家族，含有2個結(jié)構(gòu)域，即C-端的 HIN 結(jié)構(gòu)域和 N-端的PYD。AIM2和IFI16對DNA的識別無特異性，靠帶正電荷的HIN結(jié)構(gòu)域和帶負電荷的雙鏈DNA的磷酸糖骨架的靜電吸引結(jié)合。HIN結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合面含2個結(jié)合寡聚核苷酸／寡糖（oligonucleotide／oligosaccharide binding，OB）的折疊以及OB折疊之間的連接。AIM2和IFI16無NLR類似的NACHT結(jié)構(gòu)域，不能自身寡聚化，而是以DNA為平臺進行寡聚化。DNA與HIN結(jié)構(gòu)域的結(jié)合釋放出AIM2和IFI16內(nèi)的PYD，激活受體，促進PYD與ASC互作，募集并激活procaspase-1，釋放促炎因子［5］。

1.3 RIG-1及其炎癥復合體的組裝

視黃酸誘導基因I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-1）含有RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域和CARD。解旋酶結(jié)構(gòu)域識別病毒基因組雙鏈RNA的5′-三磷酸，通過MAVS和CARD9介導NF-κB激活，調(diào)控pro-IL-1β的合成，此外，RIG-1通過CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合ASC和procaspase-1，激活RIG-1炎癥復合體。

2 激活模式

關(guān)于炎癥復合體的激活研究十分廣泛，其中NLRP3炎癥復合體的研究最多，其激活模式有些同樣適合其他炎癥復合體，或者具有借鑒意義。目前炎癥復合體的激活模式有4種。

2.1 鉀離子外流激活炎癥復合體

該模式基于胞外高濃度的鉀離子可以抑制ATP、尼日利霉素、MSU等激活NLRP3炎癥復合體。THP-1細胞裂解后產(chǎn)生的無細胞體系放于10mmol／L的KCl溶液時，NLRP3炎癥復合體各組分自我組裝，并生成活性形式的caspase-1［6］。工作原理是胞外ATP、穿孔毒素（如尼日利亞霉素）刺激嘌呤P2X7ATP門控離子通道，觸發(fā)鉀離子外流，開放pannexin-1膜孔，DAMP或PAMP通過pannexin-1膜孔進入胞內(nèi)，激活NLRP3炎癥復合體。設(shè)置高鉀離子細胞培養(yǎng)液對絕大大多數(shù)炎癥復合體的激活都產(chǎn)生了抑制作用，包括AIM2、NLRP1、NLRC4炎癥復合體［7］。鼠傷寒沙門菌（Salmonellatyphimurium）可同時激活NLRC4和NLRP3炎癥復合體，但高濃度的鉀離子對其無抑制作用［6］。

為維持細胞的電位，細胞內(nèi)保持高濃度的鉀離子，當細胞受到刺激時鉀離子通道開放，鉀離子順濃度梯度流出細胞外，因此，通常認為細胞培養(yǎng)液設(shè)置高濃度的鉀離子環(huán)境的作用是抑制胞內(nèi)鉀離子外流，并且用鉀離子通道抑制劑處理多種細胞也同樣產(chǎn)生抑制效果，在鉀離子通道抑制劑奎納定和四乙銨存在的情況下用致死毒素（激活NLRP1b炎癥復合體）同時處理BMDM、procaspase-1和pro-IL-18產(chǎn)生活性形式過程顯著受到抑制［8］?？{定預(yù)處理LPS致敏的樹突狀細胞腺苷酸環(huán)化酶毒素誘導NLRP3炎癥復合體是的激活，從而降低IL-1β的分泌。缺氧／再充氧誘導心肌成纖維細胞炎癥復合體激活并釋放IL-1β，鉀離子通道抑制劑格列美脲、格列本脲、四乙銨對其產(chǎn)生抑制作用。

鉀離子外流理應(yīng)伴隨胞內(nèi)鉀離子濃度的降低，但poly（dA∶dT）激活A(yù)IM2炎癥復合體過程中卻未檢測到該現(xiàn)象［7］，鼠傷寒沙門菌和銅綠假單胞菌感染BMDM激活炎癥復合體，胞內(nèi)鉀離子濃度略微降低，但無顯著差異。綜上所述，鉀離子外流激活炎癥復合體未能解釋受體如何識別配體，尤其是NLRP3識別結(jié)構(gòu)迥異的配體。

2.2 溶酶體受損激活炎癥復合體

溶酶體受損激活炎癥復合體模式認為一些晶體或顆粒物質(zhì)被細胞吞噬后進入細胞內(nèi)，損傷溶酶體，釋放溶酶體內(nèi)容物到胞漿，NLRP3炎癥復合體識別后激活。Veit Hornung等發(fā)現(xiàn)二氧化硅激活NLRP3炎癥復合體，釋放IL-1β，使中性粒細胞進入肺內(nèi)。細胞吞噬晶體后溶酶體受損，激活NLRP3炎癥復合體。利用非晶體物質(zhì)損傷溶酶體，如導入熒光右旋糖酐或L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯處理也可激活NLRP3炎癥復合體，表明二氧化硅或鋁鹽等晶體或顆粒物質(zhì)激活NLRP3炎癥復合體是通過使溶酶體失穩(wěn)的途徑。

溶酶體損傷激活炎癥復合體可能是由溶酶體釋放的組織蛋白酶B介導。β淀粉樣變化引起小膠質(zhì)細胞溶酶體損傷，釋放大量組織蛋白酶B，激活炎癥復合體，組織蛋白酶B抑制劑CA-074-Me處理后，細胞釋放IL-1β減少。多糖激活THP-1細胞NLRP3炎癥復合體同樣也受到CA-074-Me抑制［9］。組織蛋白酶B在其他炎癥復合體過程中也發(fā)揮著作用，致死毒素處理小鼠或者大鼠BMDM和RAW264.7引起組織蛋白酶B大量釋放，添加CA-074-Me后可抑制炎癥復合體激活。乙?；募せ頣HP-1細胞NLRP7炎癥復合體過程中，組織蛋白酶抑制劑處理可抑制該通路釋放的IL-1β。然而，瘧原蟲色素、尿酸鈉晶體和鋁刺激組織蛋白酶B缺失的BMDM和骨髓源的樹突狀細胞，與野生型相比，caspase-1活化和IL-1β釋放均沒有差異，表明組織蛋白酶B并不是誘導NLRP3炎癥復合體激活的介質(zhì)。

2.3 活性氧簇激活炎癥復合體

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是一種含氧原子的自由基，主要包括雙氧水（H2O2），超氧化物陰離子，羥基自由基。這些分子因含有為配對的電子層而高度活躍。機體感染細菌、病毒或者受到傷害時ROS的生成是進化上非常保守的通路，ROS進一步激活炎癥復合體。該模式將各種不同的激動劑激活炎癥復合體匯聚到一條共同的通路上，很好的解釋了結(jié)構(gòu)差異很大的激動劑如何與炎癥復合體的受體結(jié)合。Cruz等研究發(fā)現(xiàn)ATP處理肺泡巨噬細胞引起嘌呤受體P2X7與其他嘌呤受體連接生成ROS，ROS刺激PI3K磷酸化，磷酸化并激活絲氨酸／賴氨酸激酶的下游通路Akt和ERK1／2。磷酸酶PTEN可去除三磷酸肌醇的3′-磷酸，抑制PI3K通路，ATP處理巨噬細胞后通過介導PTEN谷胱甘肽化引起其失活。ERK1／2通路的激活調(diào)控炎癥復合體組裝和caspase-1活化，釋放IL-1β和IL-18。ROS生成在炎癥復合體的激活過程中同樣也有普遍性。弗朗西斯菌（Francisellanovicida）弱毒株在感染BMDM早期誘導釋放mROS，間接激活A(yù)IM2炎癥復合體［10］。BMDM感染炭疽致死毒素后生成ROS，procaspase-1生成活性形式的p20［11］。鞭毛蛋白誘導細胞NLRC4炎癥復合體激活的過程也生成 ROS［12］。

炎癥復合體的活性對ROS的來源具有選擇性。ROS主要來源于線粒體，同時也由一些細胞酶的活性產(chǎn)生，如NADPH氧化酶，黃嘌呤氧化還原酶，脂肪酶，環(huán)氧化酶。巨噬細胞缺失3種NADPH氧化酶的特異性亞基NOX1、NOX2和NOX4后，NLRP3的活性不受影響。抑制生成ROS的呼吸鏈復合物Ⅰ和復合物Ⅲ或線粒體活性后NLRP3炎癥復合體的活性受到抑制，抑制自噬和線粒體自噬延長受損線粒體在胞內(nèi)的存在周期增強炎癥復合體的活性，并且NLRP3炎癥復合體的組裝發(fā)生在線粒體結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria-associated ER membranes，MAMs）上，因此認為線粒體來源的ROS激活NLRP3炎癥復合體。ROS在弗朗西斯菌激活A(yù)IM2炎癥復合體的激活起著關(guān)鍵作用。與弱毒株新兇手弗朗西斯菌可激活A(yù)IM2炎癥復合體相反，強毒株土拉熱弗朗西斯菌由于對ROS有耐受作用，從而不能激活A(yù)IM2炎癥復合體［10］。

ROS在炎癥復合體激活過程中的作用尚不清楚。盡管使用ROS抑制劑清除ROS后NLRP3和NLRC4炎癥復合體激活受到抑制，但血清淀粉樣蛋白A激活NLRP3炎癥復合體以及poly（dA：dT）激活A(yù)IM2過程中卻不受到ROS抑制劑的影響［13］。與AIM2和NLRC4炎癥復合體相比，NLRP3炎癥復合體需要致敏，誘導促炎因子表達上調(diào)，ROS在NLRP3炎癥復合體活化過程中起著致敏的作用，而不是激活。

2.4 鈣離子遷移激活炎癥復合體

鈣離子或鈣離子感知受體（CaSR）激動劑可直接激活NLRP3炎癥復合體，而不需要外源性的ATP刺激。CaSR通過磷脂酶C（PLC）催化生成三磷酸肌醇，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子儲庫釋放鈣離子，導致胞漿鈣離子濃度升高，促進NLRP3炎癥復合體的組裝。同時，NLRP3可直接和cAMP結(jié)合，結(jié)合后負調(diào)控NLRP3炎癥復合體的激活［14-15］。

Horng T［16］認為 NLRP3炎癥復合體的激動劑誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲庫釋放鈣離子到胞漿，線粒體攝入鈣離子后引起鈣離子過載，導致線粒體受損，生成mROS，同時線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，最終激活NLRP3炎癥復合體。該假設(shè)認為鈣離子通路是NLRP3炎癥復合體激活的中間步驟，最終通過觸發(fā)線粒體失穩(wěn)，生成線粒體相關(guān)的配體。目前已知的線粒體源的配體有線粒體DNA（mtDNA）和心磷脂。ATP處理細胞后引發(fā)線粒體功能失調(diào)和凋亡，釋放氧化的mtDNA到胞漿，mtDNA結(jié)合NLRP3后激活炎癥復合體。缺失mtDNA后NLRP3炎癥復合體激活程度下降，因此，mtDNA直接調(diào)控其激活［17］。環(huán)孢菌素A抑制MPT開放引起mtDNA釋放減少，表明mtDNA通過MPTP進入胞漿。位于線粒體內(nèi)膜的mtDNA在線粒體失穩(wěn)時可重定位到外膜，激活NLRP3炎癥復合體。

鈣離子遷移僅能激活NLRP3炎癥復合體，對AIM2和NLRC4炎癥復合體不起作用，下調(diào)鈣離子感知受體的表達或干擾鈣離子信號轉(zhuǎn)導對后兩者的激動劑誘導IL-1β的分泌無抑制作用。

3 炎癥復合體的調(diào)控

3.1 自噬與炎癥復合體的關(guān)系

自噬與炎癥復合體是天然免疫的兩個核心機制。自噬是機體通過溶酶體降解不必要的或功能失調(diào)的細胞成分，從而維持細胞能量水平，實現(xiàn)細胞器的更新，促進細胞存活。自噬體的形成與炎癥復合體的組裝在細胞在空間上共定位，在功能上相互調(diào)控。影響自噬的功能蛋白調(diào)節(jié)炎癥復合體的激活［18］。LPS和 ATP處理自噬蛋白 LC3B-／-和自噬上游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子Becn1＋／-小鼠的巨噬細胞導致線粒體受損增強，生成大量ROS，生成的caspase-1活性形式p10和p20顯著多于野生型，分泌的IL-1β也顯著增多［19］。自噬相關(guān)蛋白Atg16L1募集Atg12-Atg5偶聯(lián)物到分離膜，誘導LC3B結(jié)合磷脂酰乙醇胺。LPS或鼠傷寒沙門菌等刺激Atg16L1-／-巨噬細胞后caspase-1的活化和IL-1β的釋放顯著減少。藥理學抑制劑或誘導劑同樣可以通過影響自噬調(diào)節(jié)炎癥復合體的激活。自噬抑制劑3-MA或渥曼青霉素處理細胞后，NLRP3和AIM2炎癥復合體的激活增強，自噬誘導劑雷帕霉素或饑餓誘導細胞自噬后炎癥復合體的激活減弱［17-19］。

自噬與炎癥復合體相互調(diào)控的機制目前尚不清楚。第一種觀點認為通過第二信使相互調(diào)控，第二信使丟失后二者的相互作用受到抑制。溴化乙錠處理細胞2周，抑制mtDNA復制，誘導細胞mtDNA喪失后細胞中pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達不受影響，但IL-1β的分泌顯著降低。LPS和ATP處理細胞后誘導線粒體釋放 mtDNA，LC3B-／-和Becn1＋／-小鼠的巨噬細胞釋放的mtDNA顯著增多，同時伴隨caspase-1的活化和IL-1β的分泌增多。第2種觀點認為通過自噬蛋白相互調(diào)控，如LC3B、Bcl-2、Atg5-Atg12復合物等。第3種觀點認為pro-IL-1β合成后被自噬體隔離，雷帕霉素誘導自噬后自噬體降解pro-IL-1β，從而阻斷IL-1β的分泌，3-MA抑制自噬后促進pro-IL-1β的加工。第4種觀點認為AIM2和NLRP3炎癥復合體形的激活誘導G蛋白RalB和自噬體的形成，進而清除活性的炎癥復合體。自噬體的形成依賴于炎癥復合體識別受體AIM2和NLRP3的存在，而不是ASC和caspase-1［19］。

3.2 新蛋白質(zhì)的合成與炎癥復合體的關(guān)系

炎癥復合體的激活有兩個步驟，分別需要兩個信號：第一信號誘導炎癥復合體活化所需的成分的合成，主要包括pro-IL-1β，稱為致敏；第二信號誘導炎癥復合體組裝，caspase-1自我切割形成活性形式的p10和p20，切割pro-IL-1β成為活性形式，并釋放到體外。pro-IL-1β的合成是炎癥復合體活化的基礎(chǔ)。炎癥復合體的激活分為兩個階段，前期是快速激活，細胞在受到應(yīng)激后迅速觸發(fā)炎癥復合體的組裝，切割細胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的的pro-IL-1β并分泌到胞外，這一階段炎癥復合體的激活獨立于新蛋白質(zhì)的合成，依賴于 Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和識別受體的實時激活，通過TLR信號通路的白介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1receptorassociated kinase，IRAK-1）直接調(diào)控；后期炎癥復合體的激活依賴于新蛋白質(zhì)的合成，獨立于IRAK-1［20］。新蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己烯亞胺和LPS同時處理細胞10min，再用ATP激活NLRP3炎癥復合體并不影響caspase-1的活化［21］。環(huán)己烯亞胺處理巨噬細胞30min，再用LPS和尼日利亞霉素激活NLRP3炎癥復合體，caspase-1的活化受到阻斷，然而用鼠傷寒沙門菌和poly（dA：dT）刺激細胞，其活化不受影響。

3.3 泛素化／蛋白酶體通路與炎癥復合體的關(guān)系

泛素化／蛋白酶體通路是機體降解并回收外源蛋白質(zhì)以及衰老或損傷的細胞器，用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和除去錯誤折疊蛋白質(zhì)的主要機制。泛素化／蛋白酶體降解蛋白質(zhì)過程為：需要被蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)會先被連接上泛素作為標記，去折疊后進入20S核心顆粒的內(nèi)部孔道，由20S核心顆粒中的β亞基進行蘇氨酸依賴的親核攻擊。

泛素化／蛋白酶體通路調(diào)節(jié)炎癥復合體主要通過降解炎癥復合體的主要成分。胞漿中的NLRP3合成后處于被泛素化標記，LPS和ATP處理細胞后NLRP3去泛素化后活化，去泛素化酶抑制劑處理抑制NLRP3去泛素化阻斷炎癥復合體的激活［21］。去泛素化酶BRCC3是NLRP3去泛素化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，靶向NLRP3成為BRISC復合物的底物，促進NLRP3去泛素化［22］。ASC活化也需要去泛素化酶的參與。ASC合成后被線性泛素鏈組裝復合物線性泛素化，在炎癥復合體激動劑刺激下，ASC去泛素化后寡聚化而活化，由于NLRC4炎癥復合體的組裝中ASC不是必需成分，因此去泛素化酶抑制劑對其激活沒有影響［23］。pro-IL-1β同樣也由泛素化／蛋白酶體通路降解，去泛素化酶抑制劑通過促進pro-IL-1β的降解，從而抑制炎癥復合體的活化［24］。

4 總結(jié)

目前一般認為鈣離子遷移激活炎癥復合體是最具說服力的模式，但鉀離子對該模式同樣存在調(diào)控作用。炎癥復合體的調(diào)控因素較多，包括自噬、新蛋白質(zhì)的合成和泛素化／蛋白酶體通路的影響，并且不同的炎癥復合體的調(diào)控差異較大。在過去的10年里，炎癥復合體激活的機理研究取得了重大進展，但在激活模式和調(diào)控還有很大研究空間，而炎癥復合體的研究也必將為炎癥相關(guān)疾病的防治提供更有效的思路。

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