張 巖，李 建，宮利娜，高航飛，李旭東，安維雪，申之義

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

布魯菌病（Brucellosis）是一種全世界廣泛分布的人獸共患慢性傳染病，布魯菌病流行范圍廣，不易根除，不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人類(lèi)和動(dòng)物的健康［1］?？刂撇剪斁鞑サ淖钣行侄问且呙缑庖呓臃N，而目前預(yù)防布魯菌病的最好疫苗是減毒活疫苗［2］，主要有 S2、M5、S19、Rev.1等，我國(guó)主要使用S2疫苗。目前，布魯菌的檢測(cè)主要依靠細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)雖然可以直接觀察到布魯菌，得出確定的診斷結(jié)論；但布魯菌的培養(yǎng)通常需要3d～7d時(shí)間，操作具有一定的危險(xiǎn)性，并且陽(yáng)性率偏低，需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作［3］；免疫學(xué)技術(shù)是動(dòng)物布魯菌檢測(cè)的常規(guī)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在不足，如檢測(cè)依賴于動(dòng)物體內(nèi)抗體水平會(huì)因?yàn)榭贵w交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性，血清學(xué)陽(yáng)性只能推斷感染，卻不能確定感染狀態(tài)是持續(xù)感染還是耐過(guò)狀態(tài)［4］。

PCR方法無(wú)需高級(jí)別防護(hù)要求，具有快速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前較為重要的布魯菌檢測(cè)手段。雖然布魯菌基因片段在種屬之間具有較高的同源性［5］，易出現(xiàn)特異性不佳、假陽(yáng)性等情況［6］，但仍然可以區(qū)分布魯菌屬及大部分種［7-9］，甚至區(qū)分S19疫苗株和野毒株［10］，只是目前尚無(wú)實(shí)用的PCR方法能鑒別出S2疫苗株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime PCR）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，突出特點(diǎn)是快速、無(wú)需電泳并能避免污染，但是realtime PCR成本高，限制了其應(yīng)用范圍和普遍適用性［11］。為了鑒別出疫苗免疫和布魯菌感染，通過(guò)查閱文獻(xiàn)和對(duì)NCBI公布的布魯菌毒株基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)只有S2疫苗株在IclR基因存在25bp的缺失，根據(jù)缺失部分設(shè)計(jì)核酸探針，用以檢測(cè)S2疫苗株，新的診斷方法對(duì)布魯菌病的預(yù)防和控制有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 布魯菌S2疫苗株由金宇保靈生物公司提供；布魯菌M5株、M28株、16M株、豬1330株、牛544A株由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；流產(chǎn)沙門(mén)菌、多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌、大腸埃希菌、牛支原體由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室和微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（eppendorf AG 22331Hamburg Garrmany）為 Eppendorf產(chǎn)品；水浴鍋（HW.SY11-K）為北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品；凝膠成像儀（SYDR412391）為 Gene Campany Limited GBOX HR made in the VK 產(chǎn)品 ；DNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、pMD19-T 連接試劑盒、DNA Marker 500為 TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為美國(guó)AXYGEN公司產(chǎn)品；Gene JET Gel Extraction Kit為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ?yàn)镽oche公司產(chǎn)品；其他試劑為實(shí)驗(yàn)室分析純；耗材為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照NCBI公布的Brucella suis bv.1str.S2chromosome1全序列（CP 006961.1），利用 Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條探針，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上 游 引物：5′-ATGAAGGGCGTGGCGAAGGA-3′下 游 引 物：5′-AAGGCGATTTGCGGGTGG-3′S2 探 針：5′-CAGTTTCCAAGGTCGGCTACGAACAGCGT-3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取 試驗(yàn)菌種復(fù)蘇后，各挑取單個(gè)菌落到1.5mL適宜液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，80℃水浴鍋滅活1h，然后按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)初步定量的核酸置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR方法的建立 25μL的反應(yīng)體系中，8.5μL去離子水，稀釋好的上、下游引物各1μL，模板2μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用30g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，然后用Gene JET Gel Extraction Kit試劑盒膠回收目的片段，定量后置-20℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物鑒定 S2疫苗株P(guān)CR擴(kuò)增的特異性條帶膠回收后，按常規(guī)方法克隆進(jìn)pMD19-T載體，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 探針特異性檢測(cè) 雜交過(guò)程按羅氏DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：分別將純化的布魯菌S2株、M5株、M28株、16M 株、豬1330株和牛544A的PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物于沸水中變性10min后迅速置冰水浴冷卻10min；取變性樣品2μL，點(diǎn)于處理好的NC膜上120℃烘烤固定30min；預(yù)雜交30min后42℃雜交液（地高辛探針25ng／mL）中雜交4h。雜交完成后，首先以2×SSC（含1g／L SDS，W／V）25℃晃動(dòng)洗滌2次，每次5min；再以0.5×SSC（含1g／L SDS，W／V）51℃洗滌2次，每次15min；洗滌后的NC膜置100mL封閉液中，25℃封閉30min；然后置于抗DIG抗體液（1∶5 000）中25℃孵育30min，接著用洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min；以檢測(cè)緩沖液室溫平衡5min，置于20mL底物顯色液中，避光顯色1h；最后以適量滅菌雙蒸水洗滌5min終止反應(yīng)，觀察結(jié)果并照相（重復(fù)3次）。

1.2.5 探針敏感性檢測(cè) 將變性的膠回收產(chǎn)物稀釋為25、1ng／μL、100、10、1、0.1pg／μL及陰性對(duì)照，分別取2μL點(diǎn)于處理好的NC膜上，按1.2.4步驟進(jìn)行斑點(diǎn)雜交和顯色，觀察結(jié)果并照相（重復(fù)3次）。

1.2.6 病料中S2疫苗的檢測(cè) 從某免疫過(guò)S2疫苗的牛場(chǎng)隨機(jī)采取10份血樣，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并應(yīng)用建立的布魯氏菌S2疫苗株的斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取試驗(yàn)菌株基因組DNA為模板，使用自主設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。取常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，在30g／L瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，采用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果，按照25μL反應(yīng)體系和PCR循環(huán)程序，在退火溫度為56℃時(shí)，選取的布魯菌株都能獲得預(yù)期的PCR條帶。M5、M28、16M、豬1330、牛544A株均能擴(kuò)增出約360bp左右的條帶；S2疫苗株擴(kuò)增出約330bp的條帶；流產(chǎn)沙門(mén)菌、多殺性巴桿菌、葡萄球菌、大腸埃希菌、牛支原體均沒(méi)有任何可見(jiàn)條帶。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 布魯菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of Brucellastrains

2.2 PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

S2疫苗株P(guān)CR擴(kuò)增的特異性條帶膠回收后，按常規(guī)方法克隆進(jìn)pMD19-T載體，陽(yáng)性菌株送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序獲得的基因序列使用DNA Star軟件中的MegAlign進(jìn)行拼接，然后登陸NCBI，使用Blast進(jìn)行比對(duì)，S2疫苗株P(guān)CR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與Brucellasuisbv.1str.S2chromosome1，complete sequence（Sequence ID：gb｜CP 006961.1｜246683-247016）序列一致，說(shuō)明擴(kuò)增的片段正確。

2.3 探針特異性檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)42℃雜交液雜交4h及免疫顯色反應(yīng)后，雜交膜上僅陽(yáng)性對(duì)照和S2疫苗株出現(xiàn)斑點(diǎn)，其他菌株未出現(xiàn)斑點(diǎn)（3次重復(fù)結(jié)果一致），結(jié)果見(jiàn)圖2，因此該探針具有特異性。

圖2 探針特異性結(jié)果Fig.2 The results of probe specificity

2.4 探針敏感性檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)42℃雜交液雜交4h及免疫顯色反應(yīng)后，結(jié)果顯示，25、1ng／μL、100、10pg／μL均能顯色，且斑點(diǎn)顏色隨著濃度的遞減而變淡，而1、0.1pg／μL、陰性對(duì)照未顯色（3次重復(fù)結(jié)果一致），結(jié)果見(jiàn)圖3，因此該探針最低檢測(cè)量為10pg／μL。

圖3 探針敏感性結(jié)果Fig.3 The results of probe sensitively

2.5 病料中S2疫苗的檢測(cè)結(jié)果

提取的樣本DNA用自主設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示10個(gè)樣本有6個(gè)能擴(kuò)增出約330bp的片段，其他4個(gè)沒(méi)有片段（圖4）。PCR擴(kuò)增出的片段經(jīng)過(guò)回收、變性、烘烤固定，然后進(jìn)行斑點(diǎn)雜交和免疫顯色，結(jié)果全部出現(xiàn)斑點(diǎn)（圖5），說(shuō)明擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為S2疫苗株基因序列。

圖4 樣本PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR results of samples

圖5 斑點(diǎn)雜交結(jié)果Fig.5 The results of dot blot hybridization

3 討論

布魯菌作為目前全世界反彈最為嚴(yán)重的重要人畜共患病病原，已經(jīng)成為相關(guān)學(xué)科研究的熱點(diǎn)。近10年來(lái)，布魯菌病在中國(guó)流行情況越來(lái)越嚴(yán)重，畜群和人群中布病感染率逐年上升，再次嚴(yán)重地威脅著畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生［12］。目前布魯菌病的診斷方法有多種，以病原學(xué)和免疫學(xué)為主［13］，但是這些方法大多不完善，而且沒(méi)有快速、準(zhǔn)確、易操作的檢測(cè)方法能鑒別出疫苗免疫和自然菌株感染，鑒于布魯菌病對(duì)公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的嚴(yán)重影響，全球各國(guó)對(duì)凈化、根除布病的要求也愈來(lái)愈迫切 。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和對(duì)NCBI發(fā)表的布魯菌株基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)S2疫苗株在IclR基因存在25bp（SequenceID：gb｜CP006961.1｜：246968-246969）的缺失，而其他菌株沒(méi)有缺失，根據(jù)缺失部分，設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為29bp的探針，針對(duì)該探針位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增出的基因包含探針，這樣就將PCR的敏感結(jié)合進(jìn)來(lái)，使該診斷方法具有高特異性，高敏感性。

本試驗(yàn)建立了相對(duì)完善的布魯菌斑點(diǎn)雜交鑒別方法，能準(zhǔn)確的鑒別出布魯菌S2疫苗株，具有重要的生產(chǎn)實(shí)際意義。斑點(diǎn)雜交方便快捷，膜制備時(shí)間短，并且可以大量制備后置于4℃保存半年之久，探針可以重復(fù)利用，從病料中提取DNA開(kāi)始，經(jīng)過(guò)一次PCR擴(kuò)增和一次雜交就能準(zhǔn)確快速進(jìn)行診斷，鑒定過(guò)程不超過(guò)10h，既可以確定是否是布魯菌屬，又可以區(qū)分S2疫苗株和其他菌株。本研究建立的核酸探針檢測(cè)方法充分利用了PCR的高靈敏度和斑點(diǎn)雜交的高特異性，不僅為布魯菌病的防控及生物安全提供了快速、安全、便捷的技術(shù)支持，也可作為布魯菌病臨床診斷的輔助手段。

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