王繼練，張煥容，郝一妹

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

牦牛巴氏桿菌?。≒asteurellosis）是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）引起的牛的一種急性敗血性傳染病，又稱(chēng)牛出血性敗血癥。以肺炎、急性胃腸炎及內(nèi)臟器官?gòu)V泛出血等為主要特征［1］，臨床表現(xiàn)為高度呼吸困難和體溫升高、氣喘、鼻腔流出漿液性泡沫樣滲出物［2］，慢性經(jīng)過(guò)表現(xiàn)為皮下組織、關(guān)節(jié)、各臟器的局限性化膿性炎癥，急性胃腸炎［3-4］。該病多呈散發(fā)性或地方流行［5］，主要發(fā)生在牦牛飼養(yǎng)集中的高寒缺氧地區(qū)，一年四季均可發(fā)生，但秋冬季節(jié)發(fā)病較多［6］。中國(guó)是牦牛的主產(chǎn)國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)牦牛數(shù)量占世界牦牛總數(shù)1 400萬(wàn)頭的92%，分布于青海有470萬(wàn)頭，西藏415萬(wàn)頭，四川397.1萬(wàn)頭，甘肅112萬(wàn)頭，新疆25萬(wàn)頭，云南5萬(wàn)頭左右。我國(guó)近年來(lái)常有牦牛巴氏桿菌病的相關(guān)報(bào)道。1990年-2005年青海省有34個(gè)縣（市）報(bào)道牦牛發(fā)生牛巴氏桿菌病的發(fā)生，占全省行政區(qū)劃縣數(shù)的77.3%，發(fā)生疫情467起，發(fā)病牛29 032頭，死亡牛9 453頭［7］。2004年-2008年5年間，牦牛巴氏桿菌病在青海省天峻縣6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有發(fā)生，占全縣行政規(guī)劃鄉(xiāng)鎮(zhèn)數(shù)的60%，共發(fā)生疫情10起，疫點(diǎn)共10個(gè)，發(fā)病率5.9%（87／1 466），平均致死率為57.47%（50／87）［8］。2010年-2012年，調(diào)查組在甘肅南部牧區(qū)設(shè)定了8個(gè)調(diào)查點(diǎn)，共計(jì)對(duì)8 100余頭牦牛進(jìn)行了巴氏桿菌發(fā)病流行病學(xué)情況調(diào)查，牦牛巴氏桿菌病在甘南牧區(qū)平均發(fā)病率達(dá)6.87%，病死率達(dá)28.7%［9］。巴氏桿菌病給牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［10］。

本文對(duì)2014年11月初四川甘孜州某牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病牦牛進(jìn)行臨床診斷、病理剖檢變化、細(xì)菌的分離純化和染色鏡檢，PCR鑒定及致病性試驗(yàn)，最終確診該牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的疫病為多殺性巴氏桿菌引起的牦牛巴氏桿菌病，為該病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為杭州微生物公司產(chǎn)品；胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；10×buffer、Mg2＋、dNTP、ExTaqDNA 聚合酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；DNA MarkerⅠ、DH5α大腸埃希菌為 Tiangen公司產(chǎn)品；E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（D2501-01）和 E.Z.N.ATMPlasmid MiniKit（D6942-01）為美國(guó)Omega生物技術(shù)公司產(chǎn)品；pMD19-T序列載體試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18g～22g健康昆明小鼠10只，由成都中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)［11］設(shè)計(jì)多殺性巴氏桿菌的上、下游引物Pm KmT1和Pm KmT2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 多殺性巴氏桿菌檢測(cè)引物Table 1 Primers for detection of Pasteurella multcida

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 病料來(lái)自于四川省甘孜州某牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)病死牦牛，無(wú)菌采取心、肝、脾、肺和淋巴結(jié)等樣本。

1.2.2 臨床癥狀及剖檢病變 發(fā)病牦牛體溫升高，食欲減退，精神委靡，呼吸困難，發(fā)病后期糞便中帶有血液。剖檢發(fā)病牦牛發(fā)現(xiàn)呈急性敗血癥變化，肺臟和脾臟腫大，內(nèi)臟器官?gòu)V泛出血，淋巴結(jié)腫大，肺泡內(nèi)有大量帶血泡沫，胸腔有滲出液。

1.2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鑒定 無(wú)菌采取病死牦牛心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)等組織材料劃線(xiàn)接種于含50mL／L胎牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板上，將每個(gè)組織器官分離到的菌落分別接種到普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血液瓊脂平板和含50mL／L胎牛血清的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24h～48h，觀察各組織分離細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，并進(jìn)行革蘭染色鏡檢，無(wú)菌采取的組織觸片后瑞氏染色并鏡檢觀察。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將分離細(xì)菌培養(yǎng)菌液接種5只昆明小鼠，每只小鼠頸部皮下注射0.2mL菌液，注射后觀察小鼠精神狀態(tài)及發(fā)病死亡情況。同時(shí)對(duì)5只小鼠腹腔注射生理鹽水（每只0.2mL）作為對(duì)照［12］。對(duì)死亡或?yàn)l死小鼠處死后無(wú)菌采取小鼠心血、肝、脾等組織，劃線(xiàn)接種于含50mL／L胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～48h后革蘭染色鏡檢觀察，同時(shí)對(duì)心血涂片、肝和脾組織觸片進(jìn)行瑞氏染色觀察。

1.2.5 分離細(xì)菌的PCR鑒定 以各組織器官分離純化的菌落作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系25μL：10×PCR buffer 2.5μL，4×dNTPs（10mmol／L）2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.2μL，模板2μL，無(wú)菌水 18.3μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃5min；94℃30s，60℃35s，72℃40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃8min。PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物用20g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 采用E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（D2501-01）回收PCR產(chǎn)物。按說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)1.5h后，將預(yù)培養(yǎng)液涂布于含有100μg／mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后挑取陽(yáng)性菌落接種至含有100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及剖檢病變

發(fā)病牦牛體溫升高，采食量下降，精神沉郁，呼吸嚴(yán)重困難，發(fā)病后期糞便帶血。剖檢死亡牦牛見(jiàn)急性敗血性變化，肺臟和脾臟腫大，內(nèi)臟器官?gòu)V泛出血，淋巴結(jié)腫大，肺泡內(nèi)有大量血性泡沫，胸腔有滲出液。根據(jù)臨床癥狀與牦牛巴氏桿菌病的臨床特征相符，初步懷疑該病是由多殺性巴氏桿菌引起的牦牛巴氏桿菌病。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

病死牦牛心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結(jié)等組織劃線(xiàn)接種培養(yǎng)，最后分離得到多株菌落形態(tài)相同的細(xì)菌，根據(jù)巴氏桿菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況不同，選擇普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、血清TSA培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠，麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，血清TSA培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落灰白色、圓形、濕潤(rùn)、呈閃光露珠樣菌落，血瓊脂培養(yǎng)未見(jiàn)溶血現(xiàn)象。

單菌落革蘭染色鏡檢見(jiàn)革蘭陰性短小桿菌，瑞氏染色呈兩極著色的桿菌（圖1、圖2），符合巴氏桿菌的染色特性。

圖1 革蘭染色Fig.1 Gram staining

圖2 瑞氏染色Fig.2 Wright’s staining

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠于注射細(xì)菌后24h內(nèi)全部死亡。剖檢可見(jiàn)心包和胸腔有漿液性、纖維素性滲出物，腸道出血明顯，肝臟表面有針尖大的灰白色壞死灶。剖檢死亡小鼠，心血涂片、肝和脾組織觸片瑞氏染色鏡檢，可見(jiàn)兩極濃染的小桿菌。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

以分離菌作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得460bp的特異性條帶（圖3），與預(yù)期片段大小一致。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳擴(kuò)增圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of target gene

分離菌PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示所獲得的序列與已公布的多殺性巴氏桿菌的KMT1基因部分序列的同源性均大于97%。結(jié)果表明分離到的菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖4 NCBI比對(duì)結(jié)果Fig.4 NCBI comparison results

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)發(fā)病牦牛的臨床癥狀和病理剖檢病變、細(xì)菌分離培養(yǎng)特征和染色鑒定結(jié)果，以及分離菌對(duì)小鼠致病性和多殺性巴氏桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果，確診該致病菌為多殺性巴氏桿菌。該牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)的疾病為牦牛巴氏桿菌病。

多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌，一般存在于健康動(dòng)物的呼吸道，當(dāng)家畜在外界誘因諸如氣溫驟變、畜體營(yíng)養(yǎng)不良、過(guò)度疲勞、擁擠、悶熱、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)拳h(huán)境應(yīng)激作用下，均可使機(jī)體抵抗力下降而發(fā)?。?3］。該牦牛場(chǎng)發(fā)病時(shí)正是剛從夏季牧場(chǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至冬季牧場(chǎng)，且由于冬季牧場(chǎng)旁噪聲巨大的礦石加工廠，牦牛轉(zhuǎn)運(yùn)和環(huán)境條件的應(yīng)激與該病的條件誘發(fā)性發(fā)生相符。因此，建議飼養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)減少導(dǎo)致該病發(fā)生的多種應(yīng)激因素［14］，平時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高飼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)水平，增強(qiáng)牦牛體質(zhì)，做好平時(shí)的預(yù)防消毒工作，牧區(qū)放牧牦牛應(yīng)注意避開(kāi)過(guò)渡陰濕草場(chǎng)放牧［15］。

對(duì)于發(fā)病區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行場(chǎng)地的消毒，具體方法可將患畜排瀉物堆積后用生石灰消毒，用200mL／L的來(lái)蘇兒對(duì)被污染過(guò)的草場(chǎng)、圈舍、用具進(jìn)行徹底消毒，尸體深埋。通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物對(duì)病牛進(jìn)行治療，避免藥物的濫用［16］。對(duì)于健康牦牛，需做好預(yù)防工作，在牦牛養(yǎng)殖過(guò)程中，實(shí)時(shí)對(duì)牦牛的飲食狀況和健康狀況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)病情及時(shí)采取隔離措施，對(duì)疫情發(fā)生地及周邊地區(qū)的假定健康牛，采用牛巴氏桿菌滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫接種，通過(guò)科學(xué)的診斷方法進(jìn)行確診，及時(shí)治療，爭(zhēng)取把疫病造成的損失降低到最低限度。

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