李鳳梅，施開創(chuàng)，許心婷，胡 杰，鄒聯(lián)斌，鐘 誠＊

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧530001）

沙門菌（Salmonella）是常見的重要人獸共患病原菌，根據(jù)沙門菌對不同宿主的侵襲力差異可以分為廣嗜性沙門菌和宿主專嗜性特異性沙門菌。雞是沙門菌最主要的宿主，雞白痢沙門菌（S.pullorum）和雞傷寒沙門菌（S.gallinarum）僅感染雞和火雞，具有高度宿主適應(yīng)性和宿主專嗜性，可以引起雛雞急性敗血癥，導(dǎo)致很高的發(fā)病率和病死率［1］；對成年雞主要侵害生殖器官，引起產(chǎn)蛋下降或生長發(fā)育受阻。同時，沙門菌具有水平傳播和垂直傳播的特點(diǎn)，一旦傳入雞群，難以控制和根除，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)最重要的病原菌之一［2］。及時、準(zhǔn)確地檢測病原菌和診斷對雞場有效防治與凈化雞沙門菌病具有重要作用。傳統(tǒng)的沙門菌檢測方法是通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化及血清學(xué)鑒定，耗時費(fèi)力，且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉，靈敏性與特異性受到局限；目前對沙門菌的快速檢測方法則多采用免疫學(xué)方法、核酸分子雜交及PCR擴(kuò)增技術(shù)等檢測抗體和病原［3］。國內(nèi)外針對沙門菌已建立的單重及多重PCR方法，多用于檢測菌株的血清型、毒力基因或耐藥基因，迄今未見報道有能夠同時檢測具有致病性沙門菌屬特異性及雞宿主特異性的多重PCR方法。本研究分別針對沙門菌屬特異性毒力因子invA 基因［4］、雞宿主特異性毒力因子fliC 基因［5］、質(zhì)粒毒力因子spvR基因［6］設(shè)計3對特異性引物，建立能夠同時檢測具有致病性并攜帶毒力質(zhì)粒的雞沙門菌的多重PCR方法，以期為雞源致病性沙門菌的快速鑒別檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及實驗動物 雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC538）、大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）、鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）來自中國微生物菌種保存中心；雞源多殺性巴桿菌、痢疾志賀菌和普通變形桿菌由廣西動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供；豬霍亂沙門菌由廣西大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室惠贈；4周齡SPF級雄性昆明小鼠購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物繁殖中心。

1.1.2 主要試劑 MinBEST Viral DNA／RNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、質(zhì)粒 DNA 小量提取試劑盒、pMD18-T載體、2×TaqPCR MasterMix試劑盒、HindⅢ及EcoRⅠ內(nèi)切酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000／DL 2 000／DL 1 500均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EscherichcoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模板制備 按照 MinBEST Viral DNA／RNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒使用說明書提取細(xì)菌總DNA。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank已發(fā)表的沙門菌屬特異性毒力基因invA、質(zhì)粒毒力基因spvR、雞宿主特異性毒力基因fliC的序列，設(shè)計3對特異性引物（表1）。其中，INVA引物對擴(kuò)增的invA基因片段為285bp，SPVR引物對擴(kuò)增的spvR基因片段為507bp，F(xiàn)LIC引物對擴(kuò)增的fliC基因片段為600bp。引物由天地楊生物科技（廣州）有限公司合成。

1.2.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照 MinBEST Viral DNA／RNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒使用說明書提取雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株總DNA。用3對特異性引物分別配制50μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 25μL，上、下游引物（25pmol／μL）各1μL，DNA模板1μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃35s，35個循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆培養(yǎng)后應(yīng)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。本研究共構(gòu)建3種重組質(zhì)粒，由引物INVA、SPVR和FLIC擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為pMDINVA、pMD-SPVR和pMD-FLIC。

1.2.4 多重PCR最佳反應(yīng)條件的確定 建立50μL PCR反應(yīng)體系，分別對模板量（將3種重組質(zhì)粒稀釋成1010拷貝／μL后等比例混合，然后以3、4、5、6、7μL混合液作為模板）、退火溫度（分別為54.1、55.3、56.5、57.7、58.9、60.1 ℃）、引物濃度（3對引物終濃度分別為 0.125、0.25、0.5、0.625、0.75、1.0、1.25、1.5pmol／μL，進(jìn)行不同濃度的排列組合）及循環(huán)數(shù)（分別為25、30、35、40、45個循環(huán)）進(jìn)行試驗，確定各自最佳的反應(yīng)條件。

表1 多重PCR特異性引物Table 1 The specific primers used for multiplex PCR

1.2.5 多重PCR的特異性試驗 提取雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌及雞源多殺性巴氏桿菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌的DNA作為模板，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，分析其特異性。

1.2.6 多重PCR的敏感性試驗 將雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株于普通培養(yǎng)基振蕩增菌過夜，取其菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，涂板計數(shù)，重復(fù)3次，計算菌液濃度；每個梯度提取DNA作為模板，在優(yōu)化條件下進(jìn)行單重及多重PCR，分析其敏感性。此外，將3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成1.67×1010拷貝／μL～1.67×101拷貝／μL（50μL反應(yīng)體系終濃度為1.67×109拷貝／μL～1.67×100拷貝／μL）共10個濃度梯度，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行單重及多重PCR，檢測其敏感性。

1.2.7 多重PCR的重復(fù)性試驗 以終濃度均為1.67×107拷貝／μL的3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合后作為模板，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，重復(fù)5次反應(yīng)，分析其重復(fù)性。

1.2.8 多重PCR的臨床應(yīng)用 2013年-2014年采集的223份來自廣西各地疑似病死雞病料，取心、肝、脾、十二指腸各約1g，混合研磨后按1∶4（W／V）加入 PBS（pH7.2），反復(fù)凍融3次，12 000r／min離心5min，取上清提取總DNA作為模板，應(yīng)用所建立的多重PCR方法進(jìn)行檢測。

1.2.9 沙門菌致病性試驗 選擇4周齡健康昆明小鼠12只，隨機(jī)分成4組，每組3只。A組為空白對照，B組為invA＋spvR基因陽性菌組，C組為invA＋spvR＋fliC基因陽性菌組，D組為invA＋fliC基因陽性菌組。對照組腹腔注射生理鹽水0.18mL／只，試驗組腹腔注射相應(yīng)菌液0.8 ×108CFU／只（0.18mL／只）。每隔8h觀察1次，直至96h。1.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用t檢驗法對致病性試驗中不同組菌株的致病性差異情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

提取雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株的總DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增相應(yīng)基因的目的片段，經(jīng)回收、連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆増菌后提取質(zhì)粒，用HindⅢ和EcoRⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得兩個片段的酶切產(chǎn)物，其中一個片段包含插入的目的基因片段以及HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間62bp的載體片段，另一片段則是不含目的基因的載體片段，表明成功構(gòu)建了沙門菌屬毒力基因invA、spvR、fliC的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為pMD-INVA、pMD-SPVR和pMDFLIC（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmids by restriction enzyme digestion and PCR

2.2 最佳反應(yīng)條件的確定

對模板濃度、退火溫度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化（以引物濃度的優(yōu)化結(jié)果為例，見圖2）。經(jīng)過優(yōu)化，確定了多重PCR最佳反應(yīng)條件，包括PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 25μL，F(xiàn)LIC引物（25pmol／μL）上、下游各1μL，SPVR引物（25pmol／μL）上、下游各1μL，INVA 引物（25pmol／μL）上、下游各0.25μL，模板量5μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃35s，35個循環(huán)；72℃10min。

2.3 特異性試驗

提取雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌及雞源多殺性巴氏桿菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌總DNA作為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株陽性對照可以擴(kuò)增到3條明顯的條帶，而大腸埃希菌、雞源多殺性巴氏桿菌、痢疾志賀菌及普通變形桿菌均為陰性，沒有交叉反應(yīng)（圖3）。

2.4 敏感性試驗

將雞沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，提取總DNA作為模板進(jìn)行單重和多重PCR。結(jié)果顯示，針對invA、spvR、fliC基因的單重PCR的檢出下限均為4.5×101CFU／mL（圖4A），而多重PCR的檢出下限均為4.5×102CFU／mL（圖4B）。同時，以3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行單重和多重PCR，結(jié)果顯示，針對invA、spvR、fliC基因的單重PCR的檢出下限均為1.67×102拷貝／μL（圖5A），而多重PCR的檢出下限均為1.67×10 拷貝／μL（圖5B）。表明單重PCR的敏感性高于多重PCR。

圖2 引物濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the primer concentration for multiplex PCR

圖3 多重PCR的特異性試驗Fig.3 The specificity test of multiplex PCR

圖4 菌液PCR的敏感性試驗Fig.4 The sensitivity test of PCR from bacterial solution

圖5 重組質(zhì)粒PCR的敏感性試驗Fig.5 The sensitivity test of PCR from recombinant plasmids

2.5 重復(fù)性試驗

以終濃度均為1.67×107拷貝／μL的3種重組質(zhì)?；旌衔餅槟０澹趦?yōu)化條件下進(jìn)行多重PCR，結(jié)果5次重復(fù)反應(yīng)均能夠擴(kuò)增出均勻一致的目的片段，重復(fù)性好（圖6）。

圖6 多重PCR的重復(fù)性試驗Fig.6 The repeatability test of multiplex PCR

2.6 臨床檢測

應(yīng)用所建立的多重PCR方法對采集的223份臨床疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出invA基因陽性27份，占12.11%（27／223），其中invA＋spvR基因陽性19份，占8.52%（19／223）；invA＋fliC基因陽性2份，占0.89%（2／223）；invA＋spvR＋fliC基因陽性6份，占2.69%（6／223）。應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》中規(guī)定的方法對以上223份臨床疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果沙門菌陽性為27份。兩種方法的符合率為100%（圖7）。

圖7 部分臨床樣品的檢測結(jié)果Fig.7 The detection results of partial clinical samples by multiplex PCR

2.7 致病性試驗

觀察接種后的小鼠，A組（正常對照組）直至96h無異常，B、C、D組小鼠均在72h內(nèi)死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為精神委靡，毛粗糙松亂，糞便有黏液；剖檢以肝、脾腫大為主，肝臟表面有針尖大小的灰白點(diǎn)。應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010中規(guī)定的檢測方法，可從肝、脾分離到沙門菌；同時，取肝、脾組織提取總DNA，應(yīng)用所建立的多重PCR進(jìn)行檢測，A組均為陰性，而B組可擴(kuò)增出285bp和507bp條帶（即invA＋spvR基因擴(kuò)增條帶）、C組可擴(kuò)增出285、507、600bp條帶（即invA＋spvR＋fliC基因擴(kuò)增條帶）、D組可擴(kuò)增出285bp和600bp條帶（即invA＋fliC基因擴(kuò)增條帶），與所接種菌株完全一致。

經(jīng)用t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，表明分別攜帶invA＋spvR基因（B組）、invA＋fliC基因（D組）、invA＋spvR＋fliC基因（C組）的沙門菌的發(fā)病率、死亡率無顯著差異。

3 討論

沙門菌種類繁多，已知有2 600多種血清型，其中禽類中已報道有38種，分屬于6個血清群。雞源致病性沙門菌除了在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)感染雞只致病外，也可在流通環(huán)節(jié)污染雞蛋、雞胴體及雞肉制品等，是目前世界上最為常見的引發(fā)食源性中毒的病原菌，WHO將沙門菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原［7］。建立雞源致病性沙門菌的快速鑒別檢測方法，對疫病的快速診斷、有效防控及食品安全具有重要意義。致病性沙門菌inv基因簇編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白，其中invA是主要的毒力因子，為沙門菌屬特有的保守序列，在非沙門菌中尚未發(fā)現(xiàn)，具有極高的屬特異性［4］；fliC基因編碼H1相抗原，H1相又稱特異相，特異性高，其Ⅰ區(qū)和Ⅷ區(qū)的保守性達(dá)100%。雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌具有高度宿主適應(yīng)性，正常狀態(tài)下無功能性鞭毛，有研究發(fā)現(xiàn)這些無運(yùn)動性鞭毛的沙門菌在其fliC基因的可變區(qū)存在位點(diǎn)變化，可由這些序列差異識別無運(yùn)動性的沙門菌［5］；spvR是編碼沙門菌毒力相關(guān)質(zhì)粒的基因，與致病力表型存在相關(guān)性，含毒力因子的質(zhì)粒在自主復(fù)制過程中將毒力因子傳給子代或在細(xì)菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，對毒力因子在細(xì)菌間的傳 遞 發(fā) 揮 重 要 作 用［6］。Radhika M 等［8］、李 小 玲等［9］均證實基于invA基因設(shè)計的引物，可以特異性地檢測致病性沙門菌，而在非沙門菌中未能發(fā)現(xiàn)invA 基因；LI J等［10］和徐耀輝等［11］針對fliC 基因Ⅰ區(qū)設(shè)計引物擴(kuò)增沙門菌，證實fliC基因具有雞宿主適應(yīng)特異性；Derakhshandeh A等 和劉華偉等針對spvR基因設(shè)計引物，可以特異性檢測到含有該毒力基因的沙門菌，而不含質(zhì)粒以及質(zhì)粒無該毒力基因的沙門菌則表現(xiàn)陰性。本研究根據(jù)上述invA、fliC和spvR基因的特點(diǎn)，設(shè)計3對特異性引物，經(jīng)過對模板濃度、退火溫度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了能夠檢測具有致病性并攜帶質(zhì)粒毒力基因的雞沙門菌的多重PCR檢測方法，并應(yīng)用于223份臨床病料的檢測，進(jìn)一步證實了所建立的多重PCR方法的可靠性。相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、血清型鑒定、動物致病性試驗等傳統(tǒng)方法，以及檢測菌株血清型、毒力基因或耐藥基因的單重和多重PCR方法，本研究所建立的多重PCR檢測方法利用一個反應(yīng)即可同時檢測具有致病性沙門菌屬特異性、雞宿主特異性并攜帶毒力質(zhì)粒的沙門菌，準(zhǔn)確、快速、省時、省力。

對來自廣西的223份臨床病料進(jìn)行多重PCR檢測，檢出沙門菌屬invA基因27份，檢出率為12.11%（27／223），其中invA＋spvR 基因陽性19份，占70.37%（19／27）；invA＋spvR＋fliC基因陽性6份，占22.22%（6／27）；invA＋fliC基因陽性2份，占7.41%（2／27），表明廣西雞群感染致病性沙門菌比較嚴(yán)重，而且流行毒株呈現(xiàn)多樣性。胡杰等［14］對廣西2006年-2012年雞沙門菌感染情況的調(diào)查表明，規(guī)模雞場沙門菌感染普遍，而且雞場陽性率和雞群個體陽性率逐年升高。近年來，對國內(nèi)不同省份的流行病學(xué)調(diào)查表明，雞群沙門菌感染率居高不下，血清型種類繁多［15-16］，而且致病性沙門菌耐藥性日益嚴(yán)重［17-18］，給沙門菌病的預(yù)防、治療和控制帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，加強(qiáng)沙門菌流行菌株的監(jiān)測，掌握流行優(yōu)勢菌株的動態(tài)，及時加以檢測和診斷，合理有效用藥，是有效防控乃至凈化雞沙門菌病的重要基礎(chǔ)。

本研究針對沙門菌屬特異性毒力因子invA基因、雞宿主特異性毒力因子fliC基因、質(zhì)粒毒力因子spvR基因所建立的雞源致病性沙門菌多重PCR方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，高效、快速等特點(diǎn)，省時、省力、節(jié)約成本，不僅可用于沙門菌的臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查，也可用于沙門菌的致病機(jī)理和免疫機(jī)理研究，不僅可用于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的沙門菌檢測，也可用于流通環(huán)節(jié)的沙門菌監(jiān)測，應(yīng)用前景十分廣闊。

［1］李靜怡，崔可琦，馮賽祥，等.雞白痢沙門菌的分離鑒定、耐藥性及分子分型研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（9）：62-65.

［2］Lutful Kabir S M.Avian colibacillosis and salmonellosis：a closer look at epidemiology，pathogenesis，diagnosis，control and public health concerns［J］.Int J Environ Res Public Health，2010，7（1）：89-114.

［3］唐 攀，崔恩慧，劉萬華，等.雞源沙門菌PFGE分型及耐藥性研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（11）：1-5.

［4］Bohaychuk V M，Gensler G E，McFall M E，et al.A real-time PCR assay for the detection ofSalmonellain a wide variety of food and food-animal matricest［J］.J Food Prot，2007，70（5）：1080-1087.

［5］EI-Aziz D M.Detection ofSalmonellatyphimuriumin retail chicken meat and chicken giblets［J］.Asian Pac J Trop Biomed，2013，3（9）：678-681.

［6］Guiney D G，F(xiàn)ierer J.The role of the spv genes inSalmonellapathogenesis［J］.Front Microbiol，2011（2）：129.

［7］Breuil J，Brisabois A，Casin I，et al.Antibiotic resistance inSalmonellae isolated from humans and animals in France：comparative data from 1994and 1997［J］.J Antimicrob Chemother，2000，46（6）：965-971.

［8］Radhika M，Saugata M，Murali H S，et al.A novel multiplex PCR for the simultaneous detection ofSalmonellaentericaandShigellaspecies［J］.Braz J Microbiol，2014，45（2）：667-676.

［9］李小玲，劉 斌，但現(xiàn)龍，等.沙門菌內(nèi)標(biāo)PCR快速檢測試劑盒的研制與應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（16）：3395-3402.

［10］Li J，Smith N H，Nelson K，et al.Evolutionary origin and radiation of the avian-adapted non-motileSalmonellae［J］.J Med Microbiol，1993，38（2）：129-139.

［11］徐耀輝，焦新安，胡清海，等.雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCRRFLP分子鑒定［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2005，26（1）：1-4.

［12］Derakhshandeh A，F(xiàn)irouzi R，Khoshbakht R.Association of three plasmid-encoded spv genes among differentSalmonellaserotypes isolated from different origins［J］.Indian J Microbiol，2013，53（1）：106-110.

［13］劉華偉，馬立農(nóng)，郭藹光，等.具毒性質(zhì)粒沙門菌的快速檢測［J］.西北農(nóng)學(xué)報，2009，18（6）：382-384.

［14］胡 杰，張步嫻，屈素潔，等.2006年-2012年廣西雞沙門菌感染情況調(diào)查［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013（6）：4-6.

［15］薛俊龍，田林君，張國權(quán)，等.山西省雞沙門菌病流行病學(xué)調(diào)查分析［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（9）：58-62.

［16］張純燕，寧宜寶，宋 立，等.臨床健康肉雞沙門菌的攜帶與血清學(xué)感染狀況調(diào)查［J］.中國家禽，2014，36（17）：58-60.

［17］劉芳萍，趙玉林，李昌文，等.雞源性沙門菌耐藥基因檢測與耐藥相關(guān)性分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35（8）：627-630.

［18］戴建華，吳 植，袁維峰.禽源致病性沙門菌耐藥表型與耐藥基因的分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：245-248.