王亞莉，齊江彤，杜開齊，張金龍，陳國軍，馬玉海，劉秋玲

空間爬行運動訓練對腦缺血幼鼠心理行為的影響

王亞莉1，齊江彤1，杜開齊1，張金龍1，陳國軍1，馬玉海1，劉秋玲2

目的 觀察空間爬行運動訓練對腦缺血幼鼠心理行為的影響。方法 59只7～8 日齡新生鼠隨機分為對照組20只，僅做頸部皮膚的切開縫合，未結扎雙側頸總動脈；腦缺血組20只，結扎雙側頸總動脈；腦缺血運動組19只，結扎雙側頸總動脈后4 d，給本組幼鼠在自制的空間運動架上進行早期空間運動訓練4周。對照組和腦缺血組不給與空間爬行訓練。應用動物行為學平臺(轉棒儀和曠場試驗)對38～40 日齡幼鼠進行運動和行為功能測定。結果 (1)腦缺血運動組和對照組幼鼠降落的潛伏期明顯長于腦缺血組(t=4.159，P<0.01；t=4.696，P<0.01)，而對照組和腦缺血運動組的幼鼠運動降落的潛伏期長短差異無統(tǒng)計學意義(t=1.418)；(2)在曠場實驗中3組幼鼠運動的總路程，以及平均速度比較差異均無統(tǒng)計學意義；(3)腦缺血運動組和對照組幼鼠的跨格次數(shù)、周邊活動時間和距離明顯長于腦缺血組(t=4.848，P<0.001，t=6.583，P<0.001；t=2.764，P<0.05，t=3.988，P<0.01；t=3.102，P<0.05，t=3.258，P<0.05),而對照組和腦缺血運動組的幼鼠的跨格次數(shù)、周邊活動時間和距離長短差異無統(tǒng)計學意義；(4)腦缺血運動組和對照組幼鼠中心活動時間及路程明顯短于腦缺血組(t=4.881，P<0.01；t=3.533，P<0.01；t=3.783，P<0.01，t=3.142，P<0.05)，腦缺血運動組和對照組幼鼠中心活動的時間和距離比較差異無統(tǒng)計學意義。結論 腦缺血幼鼠表現(xiàn)情緒異常，運動行為狀態(tài)明顯受損，早期空間爬行運動訓練可明顯改善腦缺血幼鼠運動和協(xié)調能力及認知能力。

空間爬行；腦缺血；心理；鼠

近年來，新生兒病死率明顯下降，但早產兒、圍產期窒息兒增多，使腦損傷和腦發(fā)育缺陷后遺癥的人數(shù)明顯增高。新生兒中度缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)有36.5%出現(xiàn)后遺癥，重度HIE則100%有后遺癥，某些輕型的HIE患者可能不會出現(xiàn)明顯的肢體功能障礙和智力障礙，但有可能表現(xiàn)為明顯的多動以及行為異常等心理行為改變。這些癥狀往往是到孩子上學時才被家長和老師發(fā)現(xiàn)，因為學習困難而被重視，但治療往往沒有特別的方法。研究證明，早期運動可全面提高小兒發(fā)育水平，豐富的環(huán)境刺激可促進大腦的發(fā)育，以運動作為豐富環(huán)境因素對大腦發(fā)育的作用更明顯[1]。眾所周知，早期運動訓練可以促進正常孩子的運動及智力發(fā)育，而對腦缺血缺氧引起的心理行為問題是否有改善和糾正作用呢？本研究觀察早期空間運動對腦缺血幼鼠心理行為的影響，進而為探討0～3歲嬰幼兒運動方式促進心理行為發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 59只Wister新生幼鼠購自上海斯來克實驗動物有限責任公司，體重18～22 g，在復旦大學國家標準嚙齒類動物實驗室飼養(yǎng)，20 d母乳喂養(yǎng)，10 d分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，濕度45%～55%。分為對照組(正常組，假手術組)20只、腦缺血(手術組，雙側頸總動脈結扎組)20只、腦缺血運動組19只，動物實驗獲得倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 (1)對照組(正常組，假手術組)：7～8日齡(P7～8)Wistar乳鼠用10%水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定臺上，仰臥位作頸腹側正中切口，長2～3 cm，不做頸總動脈結扎，皮膚縫合并用青霉素注射液沖洗局部皮膚；(2)腦缺血干預組 ：7～8日齡(P7～8)Wistar乳鼠用10%水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定臺上，仰臥位，常規(guī)消毒頸部皮膚，做頸腹側正中切口，長約2～3 cm，仔細分離左側頸總動脈，在左側頸總動脈其遠心端與近心端分別縫線結扎；再分離右側頸總動脈，在右側頸總動脈其遠心端與近心端分別縫線結扎；縫合皮膚，再次消毒創(chuàng)面。術后在37～38 ℃衡溫毯復溫4～6 h后返籠飼養(yǎng)。術后由母鼠喂養(yǎng)。20 d母乳喂養(yǎng)，10 d分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，濕度45%～55%。乳母順序標記1、2、3、4、5和6號。每周測定幼鼠體重。

1.2.2 空間運動器具 自制空間運動架和平衡木，具體制作方法：(1)空間運動架：運動架高15 cm，頂部安裝有3根平行的圓柱棍，圓柱棍直徑1.5 cm，間距3 cm；(2)平衡木：平衡木距離地面50 cm，長2 m，寬2 cm。

1.2.3 運動訓練方法 腦缺血運動組19只幼鼠由專人進行空間運動訓練，每天1次，每次25 min。(1)訓練人員用直徑0.8 cm，長29 cm細紙棒，協(xié)助幼鼠攀爬上運動架，然后轉動圓柱棍訓練幼鼠空間爬行，至落下地面為止，如此反復10遍；(2)然后訓練人員輕柔抓取幼鼠放置平衡木上，用上述輕紙棒驅趕幼鼠在空間平衡木爬行，每只幼鼠每次訓練爬行5遍。

1.2.4 神經行為狀態(tài)評定 于4周(P38～40) 在復旦大學腦科學研究院的動物行為學平臺所對59只Wistar鼠進行轉棒儀和曠場試驗測試，記錄數(shù)據(jù)。(1)轉棒儀為美國Med Associates大鼠轉棒儀(型號：ENV-575)。該轉棒儀分為4道，可同時檢測4只動物。轉軸選擇勻加速為4.0～40 r/min。當動物從轉軸上掉落時，切斷該道的紅外線，儀器自動記錄下時間。每次觀察5 min，重復3次，計算3次停留時間的平均數(shù)；(2)曠場試驗為美國Med Associates 大鼠曠場實驗系統(tǒng)(型號：MED-VOF-RS)。實驗裝置由曠場反應箱和數(shù)據(jù)自動采集與處理系統(tǒng)兩部分組成。大鼠曠場反應箱高30 cm，底邊39 cm×39 cm，正上方1 m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內部。曠場光照設置為黑夜模式；實驗室背景噪音控制在65 dB以下。觀察時間10 min。

1.2.5 觀測項目 轉棒儀測試選擇幼鼠降落的潛伏期(即在轉棒儀上的運動時間)作為參考指標。比較曠場試驗10 min總體反應結果，選擇幼鼠在曠場中的總路程、平均速度、跨格次數(shù)和中心與周邊區(qū)域活動時間及距離作為參考指標。

2 結 果

2.1 體重狀態(tài) 腦缺血運動組和腦缺血組及對照組幼鼠在運動前的體重無統(tǒng)計學差異，2周和4周時腦缺血運動組的幼鼠體重均非常明顯地重于其他兩組的幼鼠體重(均P<0.01，表1)。

表1 各組幼鼠訓練前后體重變化 ±s，g)

2.2 運動狀態(tài) 用轉棒儀測定幼鼠運動狀態(tài)，腦缺血運動組和對照組幼鼠降落的潛伏期明顯長于腦缺血組，而對照組與腦缺血運動組的幼鼠運動降落的潛伏期長短差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 各組幼鼠運動降落潛伏期比較 ±s)

2.3 總體心理行為狀態(tài) 10 min的總路程和平均速度3組是相似的(P>0.05)，腦缺血運動組和對照組幼鼠跨格次數(shù)非常明顯少于腦缺血組的跨格次數(shù)(表3)。

2.4 曠場周邊和中心區(qū)域活動狀態(tài) 腦缺血運動組和對照組幼鼠周邊活動時間和距離明顯長于腦缺血組，而對照組和腦缺血運動組的幼鼠周邊活動時間和距離長短差異無統(tǒng)計學意義；腦缺血運動組和對照組幼鼠中心活動時間及路程明顯短于腦缺血組；腦缺血運動組和對照組幼鼠中心活動的時間和距離比較，差異無統(tǒng)計學意義(表4)。

表3 各組幼鼠曠場總體反應結果比較 ±s)

表4 各組幼鼠曠場周邊和中心區(qū)域活動狀態(tài)結果 ±s)

3 討 論

小兒腦缺血損傷不僅造成肢體功能障礙，同時也可造成智力損傷及心理行為異常，造成患兒認知和行為異常，進而造成學習困難[1，2]。動物實驗表明，早期運動訓練可減少腦缺血誘導的STAT1表達，從而加強對腦缺血再灌注大腦皮質神經元起保護作用[3]，在顱腦損傷后3 d或7 d時進行為期2周的跑臺訓練，能改善模型大鼠肢體運動協(xié)調能力及前肢運動功能[4]。小兒心理行為伴隨著體格和智能同步快速發(fā)展，已知促進小兒早期發(fā)展的重要內容是給與小兒豐富環(huán)境刺激，運動能力發(fā)展是小兒生長發(fā)育的指標，適宜的運動訓練又是促進早期運動及協(xié)調能力發(fā)展的關鍵手段。認知能力是心理行為范疇，運動促進認知能力是治療心理行為性疾病的重要手段，在學齡兒童中，身體活動量較高的健身水平與改善認知功能相關[5]。如果對有窒息史的小兒在早期無論是否有缺血缺氧性腦病的癥狀即采取能夠促進認知能力發(fā)展的適宜運動訓練,有利于減少腦缺血損傷，同時減少神經系統(tǒng)后遺癥，如認知及行為異常。

本研究采用結扎雙側頸總動脈制作腦缺血模型。腦缺血特征性表現(xiàn)：運動功能的損害，姿勢的異常，智力及認知功能發(fā)育遲緩，故生物學行為檢驗是腦缺血動物模型檢驗中重要的手段[6]。實驗中為幼鼠設計爬高的空間運動，由于爬行運動對鼠類是常態(tài)活動姿勢，若欲發(fā)揮運動訓練的效果必須達到一定的運動頻率，而對幼鼠是不合適的；受馬力等[7]設計增加環(huán)境豐富化模具影響實驗豚鼠生長及行為研究的啟發(fā)，因此自制了幼鼠空間運動訓練器具，內容包括空間平衡木運動、空間攀爬和空間爬行運動，對幼鼠進行空間運動訓練方案，每天對幼鼠進行平衡、攀爬和空間運動訓練；既非幼鼠常態(tài)活動姿勢，也非幼鼠的危險運動，當訓練者適當協(xié)助，幼鼠就能完成。腦缺血研究中廣泛采用轉棒實驗評估動物的運動能力，腦缺血后動物在轉棒上的停留時間明顯減少，降落的潛伏期明顯縮短[8]。本實驗結果顯示，早期空間運動訓練能夠明顯的促進幼鼠生長發(fā)育，并且腦缺血運動組及對照組幼鼠從轉棒儀上降落的潛伏期非常明顯長于腦缺血組，說明運動訓練使幼鼠的運動協(xié)調性明顯增加。對腦缺血幼鼠進行空間運動訓練后，幼鼠跨格次數(shù)少、中心區(qū)域活動時間短、中心區(qū)域活動距離少和周邊區(qū)域活動時間長等，均表明幼鼠對新環(huán)境認知能力增加、情緒穩(wěn)定、能夠保持常態(tài)喜歡在周邊區(qū)活動的習性；轉棒儀用于檢測動物的運動協(xié)調性和疲勞性。腦缺血幼鼠在轉棒上停留時間長短，表示其運動協(xié)調能力可說明錐體外系、小腦及周圍神經受到損傷。轉棒實驗中降落的潛伏期時間越長提示幼鼠的協(xié)調性能越好，越不易疲勞，反之則越差。轉棒實驗分析發(fā)現(xiàn)，腦缺血組幼鼠轉棒降落潛伏期明顯低于對照組，腦缺血運動組幼鼠降落的潛伏期明顯長于腦缺血組幼鼠的降落的潛伏期。提示腦缺血幼鼠存在運動協(xié)調性下降和疲勞性增加；而運動訓練能夠明顯提高手術干預幼鼠的運動協(xié)調性和抗疲勞性狀態(tài)[9]。

曠場試驗可用于測試動物的活動量、活躍程度、探索行為及對新空曠環(huán)境的認知能力。通過觀察新異環(huán)境中自主行為、探究行為和緊張度等，可反映鼠心理行為狀態(tài)。常態(tài)幼鼠喜歡群居和洞穴，在開放的環(huán)境中，幼鼠習性是喜歡在周邊區(qū)活動；曠場試驗的場地對幼鼠來說是非常寬廣的新環(huán)境，對此開放的場所幼鼠會產生焦慮，總路程和平均速度以及跨格次數(shù)被視為反映幼鼠自發(fā)運動的主要數(shù)據(jù)[6]。

本實驗中3組幼鼠在曠場實驗運動總路程，平均速度顯示差異無統(tǒng)計學意義，而在跨格次數(shù)、周邊運動時間和路程以及中心運動時間和路程上有明顯差異，腦缺血組幼鼠明顯存在跨格次數(shù)的增多，中心活動時間及路程的增長較腦缺血運動組和對照組，說明腦缺血幼鼠存在情緒的障礙及認知功能障礙，而腦缺血運動組幼鼠周邊活動時間和路程明顯長于腦缺血組而同對照組差異無統(tǒng)計學意義，提示早期空間爬行訓練可以糾正腦缺血幼鼠的緊張焦慮的情緒異常，并增加對新環(huán)境的認知能力，保持常態(tài)的周邊活動的習性。本實驗通過對幼鼠運動行為學分析發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后幼鼠的運動協(xié)調能力及認知能力明顯受損，早期的空間爬行訓練可明顯改善腦缺血受損幼鼠的運動協(xié)調能力及認知能力，為臨床早期治療腦缺血損傷小兒的訓練治療提供理論基礎。

[1] McClendon E1, Chen K, Gong X，etalPrenatal cerebral ischemia triggers dysmaturation of caudate projection neurons[J]. Ann Neurol, 2014, 75(4):508-524.

[2] Lima-Ojeda J M1,Vogt M A1,Richter S H，etal. Lack of protracted behavioral abnormalities following intermittent or continuous chronic mildhypoxia in perinatal C57BL/6 mice[J].Neurosci Lett，2014 , 577(8):77-82.

[3] 呂威力，邢雪松，吳溪婷，等.行為學訓練對局灶性腦缺血大鼠腦組織STAT1蛋白表達的影響[J].解剖學研究，2013,35(2)：100-103.

[4] 李愛萍，沈夏鋒，胡永善，等，早期跑臺訓練對中重度顱腦外傷大鼠運動功能的影響[J].中華物理醫(yī)學與康復雜志，2013,35(4)：265-268.

[5] Chaddock L, Hillman C H, Buck S M，etal.Aerobic fitness and executive control of relational memory in preadolescent children[J].Med Sci Sports Exerc， 2011，43(2)：344-349.

[6] 王維剛，劉震澤，吳文婷，等. 曠場試驗在小鼠行為分析中的應用[J]. 中國細胞生物學學報, 2011, 33 (11): 1191-1196.

[7] 馬 力，張鵬飛，潘若文，等，增加環(huán)境豐富化模具對實驗豚鼠生長及行為的影響[J].中國比較醫(yī)學雜志，2012，22(12)：60-62.

[8] 姜莉莉，閆麗萍，張 琦.腦缺血模型動物行為學評價方法的研究進展[J].中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2012，21(11)：1046-1047.

[9] 陳 剛，李 江，李建新，等.新生乳鼠腦癱模型制作及評價[J].中華實驗外科雜志,2008,25(11):1525.

(2015-05-02收稿 2015-08-20修回)

(責任編輯 岳建華)

Psychological behavior effects of space creep exercise training for early age cerebral ischemia rats

WANG Yali1，QI Jingtong1，DU Kaiqi1，ZHANG Jinlong1,CHEN Guojun1,MA Yuhai1，and LIU Qiuling2.

1.Jiaxing Hospital of Zhejiang Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Jiaxing 314000, China; 2. Department of Pediatrics, General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China

Objective To investigate the psychological behavior effects of space creep exercise training for early age cerebral ischemia rats. Methods 59 neonatal rats were randomly divided into 3 groups, 20 in control group with only the neck skin incision and suture, without bilateral common carotid artery ligation; 20 in cerebral ischemia group with bilateral common carotid artery ligation ; 19 in cerebral ischemic exercise group , 4 days after bilateral common carotid artery ligation, given a 4 weeks creep space exercise training with homemade exercise rack. Control group and cerebral ischemia group did not receive exercise training. The Animal Behaviour Science Platform (Scotch instrument and open-field test) was used to measure the movement and behavior of these 38-40 days old rats. Results (1) The landing incubation period in cerebral ischemic exercise group and the control group was much longer than in cerebral ischemia group (t=4.159,P<0.01;t=4.696,P<0.01), while the control group and cerebral ischemia exercise group had no significant difference (t=1.418). (2) In the open field test, 3 groups had no significant difference in the total distance and average speed (allP>0.05). (3) Peripheral activity time and distance in cerebral ischemic exercise group and the control group were much longer than in cerebral ischemia group (t=4.848,P<0.001,t=6.583,P<0.001;t=2.764,P<0.05,t=3.988,P<0.01;t=3.102,P<0.05,t=3.258,P<0.05) , while the number of cross-grid times, peripheral activity time and distance between the control group and cerebral ischemic exercise group had no significant difference. (4) Center activity time and distance in cerebral ischemic exercise group and the control were was much shorter than in cerebral ischemia group (t=4.881,P<0.01;t=3.533,P<0.01;t=3.783,P<0.01,t=3.142,P<0.05), while the cerebral ischemic exercise group and the control group had no dignificent difference. Conclusion For the cerebral ischemia rats, movement and behavior state are impaired, early space creeping exercise training can significantly improve the movement, coordination and cognitive abilities.

space creep; behavior cerebral ischemia; medical psychology; rat

嘉興重點科技團隊基金(編號：201212)

王亞莉，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail:wangyali72@163.com

1.314000，武警浙江總隊嘉興醫(yī)院；2.100039 北京，武警總醫(yī)院兒科

劉秋玲，E-mail:wangyali72@163.com

R332