加味五子衍宗方及其活性部位對脂多糖誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制研究

宋芳嬌 曾克武 屠鵬飛 王學(xué)美

“腎主智，腎虛則智不足”是中醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)理論，研究室根據(jù)多年臨床經(jīng)驗和“補(bǔ)腎以益智”的中醫(yī)理論在古方五子衍宗丸基礎(chǔ)上加淫羊藿形成加味五子衍宗方，其成分包括枸杞子、菟絲子、五味子、車前子、覆盆子和淫羊藿。據(jù)前期臨床療效和實驗觀察，加味五子衍宗方可有效改善輕度認(rèn)知障礙患者的記憶功能，對海馬體積的萎縮有一定的防治作用［1］。此外，加味五子衍宗方及其總黃酮、總多糖能提高東莨菪堿所引起的記憶獲得障礙模型小鼠的膽堿能系統(tǒng)活性，提高學(xué)習(xí)記憶水平［2］。輕度認(rèn)知障礙是阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)的早期臨床表現(xiàn)。近年來，隨著對AD研究的深入，許多學(xué)者認(rèn)為AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，腦內(nèi)炎癥不僅能引起神經(jīng)炎性損傷和神經(jīng)元的退行性病變，還可能是其他病理特征(老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié))形成和發(fā)展的誘因。本研究從抗炎角度出發(fā)，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系炎癥模型為研究對象，探討加味五子衍宗方及其活性部位對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用和潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.1.2 藥物 枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子和淫羊藿均購自北京同仁堂。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清(美國Gibco公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)、NO化學(xué)法試劑盒(中國南京建成生物公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)熒光染料、4'，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4'，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)(美國Sigma公司)、兔抗大鼠iNOS，COX-2和β-actin多克隆抗體(美國CST公司)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔 IgG(美國Vector公司)、電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence ECL)試劑盒(美國Pierce公司)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、2200 PRO凝膠成像分體系統(tǒng)(美國伊斯曼柯達(dá)公司)、Sunrise-Basic酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)，UV-2401PC紫外分光光度儀(日本島津公司)。

1.2 加味五子衍宗方及其活性部位的提取和測定

(1)枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子、淫羊藿按質(zhì)量比 8∶8∶4∶1∶2∶8混合，為提高藥物提取率，溶劑采用70%乙醇，用10倍和5倍量微沸提取2遍，每遍1小時。(2)大孔樹脂柱分離:將復(fù)方提取液過大孔樹脂柱，分別用4倍柱體積純凈水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和2倍柱體積95%乙醇洗脫，收集各洗脫液。(3)將各部分洗脫液60℃低溫減壓濃縮，冷凍干燥成粉末，4℃避光保存，使用時用培養(yǎng)液或DMSO溶解(終濃度為5‰)，用0.2μm濾膜除菌后作用于細(xì)胞。(4)分離組分成分鑒定:總多糖含量檢測用酚硫法，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度儀490 nm處測定;總黃酮含量檢測用氫氧化鉀顯色法，蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度儀216 nm處測定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100μg/L鏈霉素)，每1天傳代1次。

將細(xì)胞分為空白對照組，炎癥模型組和藥物治療組。其中MTT細(xì)胞存活率檢測時藥物治療組分為復(fù)方組，水提組，20%醇提組，50%醇提組，70%醇提組和95%醇提組6組，其余抗炎機(jī)制研究實驗藥物治療組分為復(fù)方組，水提組，20%醇提組，50%醇提組4組。LPS誘導(dǎo)炎癥模型的濃度為1μg/mL，藥物濃度設(shè)置為200μg/mL。藥物治療和LPS同時處理細(xì)胞，方法參照本課題組前期實驗［3］。

1.4 MTT細(xì)胞活性分析

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系以5×104/孔密度接種于48孔板，培養(yǎng)過夜，空白組采用上述高糖DMEM培養(yǎng)基換液，模型組用LPS誘導(dǎo)炎癥，藥物組LPS與藥物同時處理細(xì)胞，刺激維持24小時，棄上清，加MTT染色，溫箱孵育4小時，棄上清，加入500μL DMSO，酶標(biāo)儀570 nm處檢測光密度(optical density，OD)值。

1.5 細(xì)胞上清液NO含量測定

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系接種于48孔板，密度為5×104/孔，空白組換液，模型組用LPS誘導(dǎo)炎癥，藥物組加藥和LPS處理，刺激維持24小時，用NO化學(xué)法試劑盒檢測NO濃度，按照說明書操作:吸取300μL培養(yǎng)液上清，加試劑1和2(NO化學(xué)法試劑盒提供)，6000 rmp離心10分鐘，取160μL上清，加入顯色劑，酶標(biāo)儀570 nm波長檢測OD值。

1.6 Western blot蛋白分析

將細(xì)胞接種于?100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，空白組換液，模型組用LPS處理細(xì)胞，藥物組LPS協(xié)同藥物處理細(xì)胞，刺激維持24小時后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液(內(nèi)有Cocktail蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞，獲取總蛋白。將總蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉5分鐘。兔抗鼠iNOS，COX-2和β-actin一抗 (1∶1000)室溫孵育2小時，充分洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育1小時，充分洗滌后加入ECL液，室溫反應(yīng)5分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.7 免疫熒光檢測核轉(zhuǎn)錄因子-κB核轉(zhuǎn)位情況

在24孔板中鋪入顯微鏡蓋玻片，多聚賴氨酸包被后，接種密度為10×104細(xì)胞于玻片上，藥物預(yù)處理30分鐘后加LPS誘導(dǎo)，溫箱孵育1小時，4%多聚甲醛包被，封閉液(0.2%tritonX－100+5%BSA)室溫孵育30分鐘，加一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜，PBS充分洗滌，加二抗(1∶200稀釋)，室溫?fù)u床1小時，PBS充分洗滌，DAPI(50μg/mL)37℃避光處理30分鐘，PBS充分洗滌，甘油-PBS封片劑封片，用熒光顯微鏡拍照。

1.8 免疫熒光檢測ROS的產(chǎn)生

將細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的24孔內(nèi)，10×104/孔，多聚賴氨酸包被后，藥物處理24小時后，PBS沖洗1遍，1μmol/L ROS熒光探針(DHE)溫箱處理30分鐘，PBS充分洗滌，DAPI處理，充分洗滌，封片，熒光顯微鏡拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各分離部位總多糖和總黃酮含量

本實驗中總多糖以葡萄糖為對照品，苯酚－濃硫酸方法檢測，總黃酮以蘆丁為對照品，紫外分光光度法檢測。本次實驗中的總方提取物含(62.35±0.05)%總多糖成分，(0.08% ±0.03)總黃酮成分，抗炎效果最好的50%醇提組中含(46.66±0.04)%總多糖成分，(4.66±0.12)%總黃酮成分，其中各洗脫成分組中，含總黃酮量最多的為70%醇提組，含總多糖量最多的為水提組，具體見表1。

2.2 各分離組分對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系存活率的影響

加味子五子衍宗方水提組、20%醇提組和50%醇提組對細(xì)胞存活率沒有明顯影響，70%醇提組和95%醇提組對細(xì)胞毒性較大，經(jīng)LSD檢驗，與空白組相比P＜0．01。因此在后續(xù)實驗中主要針對總提取物、水提組、20%醇提組和50%醇提組的抗炎機(jī)制進(jìn)行了研究，具體見表2。

表1 加味子五子衍宗方各分離部位總多糖、總黃酮含量±s，%，n=3)

表1 加味子五子衍宗方各分離部位總多糖、總黃酮含量±s，%，n=3)

醇提組總多糖含量 62.35±0.05 99.24±0.05 47.68±0.01 46.66±0.0復(fù)方組 水提組 20%醇提組 50%醇提組 70%醇提組 95%4 28.91±0.09 9.97±0.03總黃酮含量 0.08±0.03 － 3.53±0.05 4.66±0.12 5.22±0.08 3.13±0.04

表2 加味子五子衍宗方各活性部位對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系存活率的影響±s，%，n=3)

表2 加味子五子衍宗方各活性部位對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系存活率的影響±s，%，n=3)

醇提組100.01±0.51 90.40±13.92 82.22±6.01 92.09±0.37 95.75±0.29 95.24±1.95 25.24±3.75a 7.38±1.35空白對照組 模型組 復(fù)方組 水提組 20%醇提組 50%醇提組 70%醇提組 95%a

表3 MWP各活性部位對細(xì)胞上清液中NO含量的影響(±s，n=3)

表3 MWP各活性部位對細(xì)胞上清液中NO含量的影響(±s，n=3)

注:模型組與空白組相比，a P＜0.01;各藥物治療組與模型組相比，b P＜0.05，c P＜0.01。

空白對照組 模型組 復(fù)方組 水提組 20%醇提組 50%醇提組9.14±1.03 16.51±1.10a 11.88±1.73b 12.89±0.50c 13.95±0.85b 9.62±1.27c

2.3 加味五子衍宗方及其各活性部位對細(xì)胞上清液中NO的影響

NO與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，炎癥反應(yīng)中大量產(chǎn)生的NO具有細(xì)胞毒性，是炎癥反應(yīng)造成正常組織損傷的原因之一。加味五子衍宗方及其各活性部位均能降低NO產(chǎn)生，經(jīng)LSD檢驗復(fù)方組和50%醇提組與空白對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．01)，且50%醇提組要優(yōu)于其他組分和復(fù)方組，可能是神經(jīng)炎性保護(hù)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，見表3。

2.4 加味五子衍宗方復(fù)方及其各活性部位對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)調(diào)控的2個重要的炎癥相關(guān)蛋白，在炎癥反應(yīng)中具有非常重要的作用。NO和PGE2等炎性因子分別是iNOS和COX-2合成的產(chǎn)物，用Western blot檢測此兩種蛋白表達(dá)，可以幫助闡明細(xì)胞炎癥激活和藥物的抗炎機(jī)制。MWP復(fù)方及其各活性部位可降低iNOS和COX-2的表達(dá)，其中50%醇提組的抑制作用最明顯且優(yōu)于復(fù)方組，見圖1。

圖1 MWP及其活性部位對LPS激活的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系中iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響

2.5 加味五子衍宗方及其活性部位對激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系NF-κB核轉(zhuǎn)移的影響

NF-κB一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞處于非激活狀態(tài)，NF-κB存在于細(xì)胞漿，外界信號(氧化應(yīng)激、LPS或細(xì)胞因子)刺激細(xì)胞后，NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與炎癥因子的生成。如圖2所示:NF-κB被綠色熒光標(biāo)記，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色，空白組細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒有綠色熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記在核外周的細(xì)胞漿，模型組細(xì)胞內(nèi)NF-κB綠色熒光與藍(lán)色熒光有重疊現(xiàn)象，說明NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，加味五子衍宗方及其活性部位組細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光減少，說明核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象被抑制，具體見圖2。

2.6 加味五子衍宗方及其活性部位對激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系ROS含量的影響

活性氧(reactive oxygen species，ROS)參與細(xì)胞多種生理和病理形成機(jī)制，高濃度的ROS能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至壞死。DHE是ROS的熒光探針，可透過細(xì)胞膜被ROS氧化產(chǎn)生紅色熒光，根據(jù)細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生可判斷ROS的含量。DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色，如圖3所示:模型組DHE紅色熒光產(chǎn)生明顯，說明LPS可激發(fā)BV-2產(chǎn)生大量ROS，空白組和藥物組細(xì)胞紅色熒光產(chǎn)生均不明顯，其中50%醇提組紅色熒光略高于其他組，說明MWP及其活性部位能有效抑制激活細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，50%醇提組抗氧化能力較其他組弱，具體見圖3。

3 討論

隨著全世界人口老齡化速度的加快，老年期癡呆已成為全球性公共健康問題。AD在老年期癡呆中發(fā)病率最高，對AD的研究已成為熱點。加味五子衍宗方經(jīng)過多年的臨床觀察和實驗研究發(fā)現(xiàn)其有良好的臨床抗癡呆和神經(jīng)保護(hù)作用。AD的病因復(fù)雜，涉及諸多病理生理過程［4］，單一靶點藥物往往不能有效抑制病程發(fā)展，并且存在毒副作用［5］，中藥毒副作用小且在防治癡呆方面有悠久的歷史［6-7］，特別是針對像AD這種的多因素相關(guān)的復(fù)雜性疾病，更能顯示出其多靶點，多途徑的治療優(yōu)勢。

圖2 加味五子衍宗方及其活性部位對LPS激活的BV-2細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)移的影響

近年來，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在AD的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注［8］。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是神經(jīng)系統(tǒng)中的專職巨噬細(xì)胞，在AD神經(jīng)病理變化中起“雙刃劍”作用。一方面，激活的MG可吞噬β淀粉樣蛋白，減輕β淀粉樣蛋白聚集對神經(jīng)元的損傷，另一方面，激活的MG可釋放大量的炎癥因子(如NO和TNF-α)，這些炎癥因子，既可誘發(fā)腦內(nèi)炎癥，造成神經(jīng)元的炎性損傷，又能繼續(xù)誘發(fā)炎癥，產(chǎn)生炎癥瀑布效應(yīng)，形成惡性循環(huán)［9］。MG在炎癥反應(yīng)中活化并釋放炎癥因子的這一過程，可為新藥的研發(fā)提供靶點和實驗依據(jù)。本實驗用LPS誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系形成炎癥模型，通過對NF-κB信號通路中的蛋白表達(dá)和炎癥因子的釋放探討加味五子衍宗方及其活性部位對神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的機(jī)制。加味五子衍宗方及其活性部位可降低NO的釋放，抑制COX-2和iNOS蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)移和ROS的釋放，從抗炎和抗氧化方面對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，且50%醇提組的抗炎效果優(yōu)于其他活性部位和復(fù)方，為加味五子衍宗方神經(jīng)保護(hù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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