郭鳳霞 陳路曉 劉斌 姜艷艷

人參中人參皂苷類成分含量測定方法優(yōu)化

郭鳳霞 陳路曉 劉斌 姜艷艷

目的 優(yōu)化人參中皂苷類成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測定方法。方法 采用單因素考察方式,對提取方式、提取溶劑、溶劑倍量和提取時間4個因素進行考察,采用HPLC法測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量,分析比較含量測定結果。結果 人參中皂苷類成分含量測定供試品溶液制備最佳方法為采用50倍的70%甲醇回流提取人參2.5小時。結論 本實驗所建立的方法操作簡單、準確可靠、重現(xiàn)性好,為人參皂苷的含量測定提供較優(yōu)方法。

人參皂苷; 含量測定; 優(yōu)化

人參為五加科植物人參Panax gineseng C.A. Mey的干燥根和根莖,為常用名貴藥材。人參具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智的功效,臨床上用于體虛欲脫,脾虛食少,肺虛喘咳,津傷口渴,氣血虧虛。人參中主要含有皂苷、多糖、揮發(fā)油等化學成分[1],《中華人民共和國藥典》(一部)[2]中,以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1為含量測定指標性成分,對其進行質(zhì)量控制。在《中華人民共和國藥典》(一部)人參“含量測定”項下供試品溶液制備方法中,人參藥材粉末采用氯仿連續(xù)回流提取,藥渣揮去氯仿,再用水飽和正丁醇浸泡,放置過夜后超聲處理提取皂苷類成分?！吨腥A人民共和國藥典》(一部)中規(guī)定人參中人參皂苷含量限度為含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于 0.30%,人參皂苷 Rb1不得少于0.20%。

在采用人參含量測定項下方法進行供試品溶液制備時,發(fā)現(xiàn)該方法存在以下問題:(1)該方法中,氯仿回流提取的目的是為了除去脂溶性雜質(zhì),而實際工作中發(fā)現(xiàn),人參藥材粉末采用氯仿連續(xù)回流提取后,氯仿提取液幾乎無色,且蒸干后殘渣量很少,此步驟未除去脂溶性雜質(zhì);(2)采用水飽和正丁醇提取人參皂苷時,先放置過夜(約12小時),再超聲處理,此過程所需時間太長,且無實際意義,故“放置過夜”步驟可以省略;超聲處理提取皂苷類成分時,發(fā)現(xiàn)所得正丁醇提取液顏色較淺,溶液蒸干后,所得殘渣量較少,且平行操作兩份差距較大。綜合分析實驗現(xiàn)象和結果,并結合文獻[3-5]中方法推測,采用正丁醇作為提取溶劑進行超聲處理,未能把人參中皂苷類成分提取完全,故導致含量測定結果偏低且誤差較大。其原因可能在于正丁醇為脂溶性有機溶劑,在提取過程中,不能有效穿透細胞膜,因而不能將皂苷類成分完全溶出。

中藥指標性成分含量測定方法的正確性、合理性是中藥質(zhì)量控制和開發(fā)應用的基礎。針對人參中人參皂苷類成分含量測定方法中供試品溶液制備過程的不合理問題,本文擬對人參中皂苷類成分含量測定中供試品制備方法進行優(yōu)化,以保證人參含量測定結果的真實可靠,結果可信。改進后人參中皂苷類成分含量測定方法中供試品溶液制備方法簡單、適用,結果準確可靠,重復性好,為人參科學的質(zhì)量控制與評價及進一步開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

人參藥材購自河北安國藥材市場(三批樣批號分別是1:140201CP390,2:301002041,3:20140416,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學生藥系張貴君教授鑒定為人參Panax ginseng C.A.Mey),甲醇、三氯甲烷、正丁醇、乙醇(分析純,北京化工試劑廠),乙腈(色譜純,塞默飛世爾科技有限公司),水(娃哈哈純凈水),人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號: 110703-201529),人參皂苷Re對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110754-201324),人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號: 110704-201424)。

1.2 儀器

Waters 1525-2489高效液相色譜系統(tǒng),Breeze2色譜工作站(美國Waters公司),Sartorius BT 25S型十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司),EQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),HH-S2二孔智控水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參照《中華人民共和國藥典》(一部)中人參含量測定項下方法色譜條件。SunFireC18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),檢測波長:203 nm,流速:1.0 mL/min,流動相A為乙腈,B為水,按表1中規(guī)定進行梯度洗脫,理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1對照品7.89 mg,人參皂苷Re對照品8.03 mg和人參皂苷 Rb1對照品8.61 mg,分別置于10 mL量瓶中,甲醇溶解、稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。分別精密量取人參皂苷Rg1對照品儲備液2.5mL,人參皂苷Re對照品儲備液2.5 mL和人參皂苷Rb1對照品儲備液2.3 mL,置于同一10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 供試品溶液制備方法的建立

2.3.1 提取方式考察 (1)藥典方法[2]:取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加三氯甲烷,加熱回流3小時,棄去三氯甲烷,藥渣揮干溶劑,連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中,精密加入水飽和正丁醇50 mL,密塞,放置過夜,超聲處理30分鐘,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉溶至5mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。

(2)回流提取:取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定重量,加熱回流2小時,取出,密塞,放冷,補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。

(3)超聲處理:取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理1小時,取出,密塞,放冷,補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。

依上述色譜條件,精密吸取對照品溶液10μL和上述供試品溶液20μL,分別進樣分析,測定色譜峰峰面積,計算含量。

由表2可見,采用回流提取方式,所測人參皂苷Rg1,人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量最高,故確定提取方式為回流提取。

表2 提取方式考察結果

2.3.2 提取溶劑考察 取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具錐形瓶中,分別精密加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇50 mL,密塞,稱定重量,加熱回流2小時,取出,補足減失的重量,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣分別加甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過0.45μm微孔濾膜,即得。

由表3可見,以70%甲醇作為提取溶劑,所測人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1含量高于其他提取溶劑結果,故選擇提取溶劑為70%甲醇。

表3 提取溶劑考察結果

2.3.3 提取時間考察 取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入70%甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流1小時,1.5小時,2小時,2.5小時,3小時,取出,放冷,補足減失的重量,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加70%甲醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過0.45μm微孔濾膜,即得。

由表4可見,加熱回流2.5小時后人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量基本不再增加,故選用2.5小時作為提取時間。

表4 提取時間考察結果

2.3.4 溶劑倍量考察 取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入70%甲醇30 mL(30倍量),40 mL(40倍量),50 mL (50倍量),60 mL(60倍量),稱定重量,加熱回流2.5小時,取出,補足減失的重量,過濾,分別取續(xù)濾液15 mL、20 mL、25 mL、30 mL置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加70%甲醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過0.45μm微孔濾膜,即得。

表5數(shù)據(jù)說明,采用50倍和60倍70%甲醇提取,所測人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量基本相當,故選擇50倍作為提取倍量。

表5 溶劑倍量考察結果

綜上,人參中皂苷類成分含量測定供試品溶液制備最佳方法為:取人參藥材粉末(過4號篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,密塞,稱定重量,加熱回流2.5小時,取出,密塞,放冷,補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加甲醇溶解,轉溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。

2.4 樣品測定

取市售三批人參藥材樣品,按樣品供試品溶液制備方法制備,測定色譜峰峰面積,計算含量。結果見表6。

表6 三批樣品測定結果(n=3)

3 討論

3.1 提取方式選擇

通過比較藥典方法、回流提取和超聲處理的含量測定結果,發(fā)現(xiàn)藥典方法測定結果明顯偏低。采用回流提取不僅可以縮短樣品處理時間,省去氯仿除雜環(huán)節(jié),節(jié)省有機溶劑,減少實驗步驟,同時可以提高人參皂苷提取率,保證實驗結果的準確度和重復性。

3.2 提取溶劑選擇

比較甲醇溶液提取與乙醇溶液提取的含量測定結果,乙醇提取率明顯較低。進一步研究發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取率略高于50%甲醇溶液提取率,且在實驗中發(fā)現(xiàn),采用50%甲醇作為提取溶劑,提取得到的水溶性雜質(zhì)較多,故選擇提取溶劑為70%甲醇溶液。

3.3 提取時間選擇

比較1小時、1.5小時、2小時、2.5小時和3小時回流提取含量測定的結果,人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量基本不變,人參皂苷Rb1的含量隨時間延長明顯增加,2.5小時后基本不再增加,故選2.5小時作為提取時間。

3.4 溶劑倍量選擇

實驗中采用50倍量和60倍量70%甲醇提取時,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量大致相同,考慮節(jié)省成本,本實驗采用50倍量70%甲醇提取。

此外,研究過程中還發(fā)現(xiàn)采用本方法處理樣品,人參皂苷提取率會明顯增加,若以此法測定人參中人參皂苷的含量,其含量限度的制訂尚待進一步深入研究。

[1] 徐靜,賈力,趙余慶.人參的化學成分與人參產(chǎn)品的質(zhì)量評價[J].藥物評價研究,2011,34(3):199-203.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:8.

[3] 曲帥.人參有效活性成分的提取分離及含量測定[D].長春:吉林大學,2013.

[4] 楊雨,鄭斯文,金銀萍,等.人參皂苷的提取分離方法研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(5):214-217.

[5] 喬雪,李月茹.黑參中7種人參皂苷含量測定[J].人參研究, 2012,24(1):10-12.

Im provement in determ ination method for Ginsenosides in Ginseng

GUO Feng-xia,CHEN Lu-xiao, LIU Bin,et al.School ofChinese Pharmacy,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:JIANG Yan-yan,E-mail:jyyjm1129@163.com

Objective To improve the determination method of ginsenoside Rg1,ginsenoside Reand ginsenoside Rb1in ginseng.M ethods Four factors including extraction method,extraction solvent, solvent volume and extraction time were studied through single-factor testmethod.And HPLCmethod was adopted to analyze the determination results of ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1. Results The best sample preparation conditions for the content determination of ginsenosides were 50 times 70%methanol,reflux extraction and duration of 2.5 h.Conclusions The improved method is simple,accurate,and reproduciblewhich could supply a bettermethod for the contentdetermination ofginsenosides.

Ginsenosides; Determination; Improvement

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.10.001

2015-05-28)

(本文編輯:董歷華)

100102 北京中醫(yī)藥大學中藥學院[郭鳳霞(碩士研究生)、陳路曉(碩士研究生)、劉斌、姜艷艷]

郭鳳霞(1990-),女,2014級在讀碩士研究生。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎研究。E-mail: gfx521713@163.com

姜艷艷(1980-),女,博士,副教授。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制方法研究。E-mail: jyyjm1129@163.com