一種新型ATP-依賴型ClpP家族蛋白質(zhì)水解酶PlclpP基因的克隆、表達(dá)和酶學(xué)特性

龔 麗， 李云霞

(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室＜上海＞，上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201306)

蛋白質(zhì)水解酶占據(jù)全球酶制劑市場(chǎng)約60%，廣 泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［1］。微生物是水解酶的主要來源，探索、開發(fā)微生物水解酶新基因資源對(duì)于解決目前商品化酶制劑種類和來源較少、底物單一、價(jià)格昂貴等問題具有重要意義。

ClpP(Caseinolytic peptidase)家族ATP-依賴型伴侶分子相連(Chaperone-linked)的酪蛋白水解肽酶廣泛存在于原核和真核生物中［2］。它們利用ATP驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)底物解折疊并轉(zhuǎn)位進(jìn)入蛋白質(zhì)水解腔(Chamber)中將蛋白質(zhì)降解成小分子肽［3］。ClpP蛋白酶于1988年首次發(fā)現(xiàn)于Escherichia coli中［4］。此后的大量研究結(jié)果表明，E.coli中ClpP蛋白酶(EcClpP)由蛋白質(zhì)水解核心ClpP和依賴ATP的伴侶分子ClpA或ClpX組成，其蛋白質(zhì)水解腔由催化位點(diǎn)序列形成的2個(gè)反向同型七聚體環(huán)構(gòu)成［2］。在國外ClpP蛋白酶已商品化，可是在國內(nèi)，迄今為止，尚無涉及ClpP家族蛋白酶的研究報(bào)道。此外，有關(guān)Paenibacillus spp.中clpP基因功能的研究國內(nèi)外均無報(bào)道。本研究采用基因克隆技術(shù)，以本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定獲得的蛋白質(zhì)水解酶高活性Paenibacillus lautus CHN26菌株基因組 DNA為模板，克隆PlclpP基因，并在E.coli BL21中進(jìn)行異源表達(dá)，為ClpP家族蛋白酶基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III購自Promega公司(美國);Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;卡那霉素和氨芐青霉素、聚丙烯酰胺和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺等SDS-PAGE試劑，以及蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒等購自生工生物工程(上海)有限公司;蛋白裂解試劑BugBuster Protein Extraction和純化試劑Ni-NTA His·Bind?resin購自Merck Millipore公司(德國);β-酪蛋白為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品(美國)。

E.coli TOP10和E.coli BL21，以及基因克隆載體pGM-T(Ampr)購自天根生物技術(shù)有限公司;基因表達(dá)載體pET-28a(Kmr)購自Merck Millipore(德國)公司;蛋白質(zhì)水解酶高活性類芽孢桿菌(P.lautus)CHN26菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存［5］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PlclpP基因的克隆 采用Primer5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計(jì)PlclpP基因PCR擴(kuò)增上、下游引物ClpP-P1f(5′-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3′)和ClpP-P1r(5′-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3′)，以及在5′端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)(以下劃線表示)的上、下游引物ClpP-P2f(5′-CG GGATCCATGGAGGATGA-3′)和ClpP-P2r(5′-CCC AAGCTTCAGT TTGGTGAC-3′)。寡核苷酸引物合成和DNA序列測(cè)定由生工生物工程有限公司(上海)完成?；蚪M和質(zhì)粒DNA的提取方法參考試劑盒說明書，參考Shi等的方法［6］進(jìn)行 PCR反應(yīng)、產(chǎn)物純化、酶切、DNA片段連接、轉(zhuǎn)化以及菌落PCR檢測(cè)等，利用CLUSTAL 2.1軟件(www.ebi.ac.uk/Tools/services)進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.2.2 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 參考Li等的方法［5］進(jìn)行PlclpP基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，組氨酸標(biāo)簽(His-tag)親和純化以及 SDSPAGE等。

1.2.3 蛋白質(zhì)水解酶活性的檢測(cè) 用β-酪蛋白為底物，在150 μl酶反應(yīng)液［含2.7 μg β-casein、5 μl 0.1 mol/L ATP、2 mmol/L ZnCl2、50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.3)］中加入50 μl純化酶進(jìn)行反應(yīng)。在40℃、pH 7.0條件下，30 min內(nèi)水解β-酪蛋白使OD562值增加0.01的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位(U)［7］。參考Li等的方法［5］測(cè)定溫度、pH值、表明活性劑(SDS、Tween-20、Tween-80)和蛋白酶抑制劑(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)對(duì)PlClpP復(fù)合物酶活性的影響。

2 結(jié)果

2.1 P.lautus CHN26菌株P(guān)lclpP基因的分子克隆及其序列分析

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中 Paenibacillus sp.Y412MC10菌株(GenBank:NC_013406.1)clpP基因序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物 clpP-P1f/r。提取P.lautus CHN26基因組DNA并以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得585 bp的單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pGM-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞。篩選、提取Ampr陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒，經(jīng) DNA序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)克隆獲得的 P.lautus CHN26 clpP基因(命名為PlclpP)編碼194個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量約為2.1×104。

BLAST序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，PlclpP序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中Paenibacillus的ATP-依賴型ClpP蛋白酶水解亞單位氨基酸序列相似性為 71%～ 98%，而與EcClpP的氨基酸序列相似性僅為62%?？墒牵琧lpP基因多序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，PlclpP基因序列含有 S14_ClpP家族特征性八肽結(jié)構(gòu)域(KDIHMYIN，59～66 aa)(圖1)。其中位于第59位的賴氨酸(Lys59，K)、第60位的天冬氨酸(Asp60，D)以及第64位的催化親核物質(zhì)(Catalytic nucleophile)酪氨酸(Tyr64，Y)為高度保守的催化三分體殘基(Catalytic triad residues)，在酪蛋白水解中發(fā)揮重要作用［8］。此外，PlclpP序列還含有絲氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位點(diǎn)(Ser99-His124-Asp173) (圖1)。

圖1 ClpP蛋白酶多序列比對(duì)分析Fig.1 Multiple sequence alignment of caseinolytic peptidase(ClpP)

2.2 PlclpP基因表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-PlclpP的構(gòu)建與鑒定

基于本研究獲得的PlclpP基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了攜帶限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)的引物 clpP-P2f/r，采用 PCR方法擴(kuò)增PlclpP基因，獲得了單一PCR產(chǎn)物。采用BamH I和Hind III雙酶切PCR產(chǎn)物，回收純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)，提取表達(dá)載體 pET-28a的質(zhì)粒 DNA，經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切為線性的DNA片段，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2所示。

將上述純化后的酶切片段經(jīng)T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有30 μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，采用菌落PCR方法篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子克隆(圖2)。提取陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒 DNA，經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證為單一DNA片段插入，大小約0.6 kb(圖2)。經(jīng)DNA序列測(cè)定驗(yàn)證插入片段為PlclpP基因。

2.3 PlclpP基因的表達(dá)和純化

采用LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/ml卡那霉素)于20℃培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coli BL21(pET-28a-PlclpP)，通過0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)18 h，獲得含有組氨酸標(biāo)簽的重組PlClpP蛋白質(zhì)，分子量約為2.1×104，與預(yù)測(cè)的ClpP蛋白質(zhì)分子量大小相一致(圖3)。同時(shí)還獲得了分子量約為2.5×104的復(fù)合PlclpP蛋白質(zhì)。利用Ni-NTA-His·Bind resin純化法，純化E.coli BL21菌體裂解后的無細(xì)胞提取液，經(jīng)SDS-PAGE分析洗脫液各組分，獲得純 化的目標(biāo)蛋白質(zhì)PlClpP(圖3)。

圖2 Paenibacillus lautus CHN26 PlclpP基因表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-PlclpP的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of the expression plasmid pET-28a-PlclpP of Paenibacillus lautus CHN26 PlclpP

2.4 PlClpP復(fù)合物的蛋白水解酶活性

以非折疊態(tài)模式底物β-酪蛋白為底物，在含有2.5 mmol/L ATP的反應(yīng)液中分析了純化PlClpP復(fù)合物在不同溫度下的蛋白水解酶活性，結(jié)果顯示PlClpP復(fù)合物的最適反應(yīng)溫度為40℃(圖4)，明顯高于P.lautus CHN26和E.coli BL21的最適生長溫度37℃。分析該復(fù)合物在不同溫度下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)PlClpP復(fù)合物在10～40℃條件下處理3 h后相對(duì)酶活性仍高于90%，說明PlClpP復(fù)合物具有嗜中溫反應(yīng)特性(圖4)。此外，還分析了pH對(duì)PlClpP復(fù)合物蛋白水解酶活性的影響，結(jié)果顯示，該復(fù)合物的最適反應(yīng)pH值為7.0。在酸性(pH≤6.0)和堿性(pH≥7.0)條件下40℃處理12 h后相對(duì)酶活性迅速下降，而在pH 6.0～7.0條件下相對(duì)酶活性大于87%，證明PlClpP復(fù)合物為中性反應(yīng)特性。

2.5 表面活性劑和蛋白酶抑制劑對(duì)PlClpP復(fù)合物酶活性的影響

用表面活性劑SDS、Tween-20、Tween-80于40℃條件下分別處理純化的PlClpP復(fù)合物1 h，然后在最適溫度和pH條件下測(cè)定殘余酶活性，結(jié)果顯示，終濃度為0.5%的表面活性劑強(qiáng)烈抑制PlClpP復(fù)合物酶活性50%～60%。相反，PlClpP復(fù)合物對(duì)常規(guī)的絲氨酸蛋白酶抑制劑具有較強(qiáng)抗性，10 mmol/L PMSF處理PlClpP復(fù)合物1 h對(duì)酶活性無明顯影響。

3 討論

迄今為止，國內(nèi)外涉及P.lautus中clpP基因功能的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究克隆鑒定了P.lautus CHN26的一種新型蛋白水解酶基因PlclpP，編碼194個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為2.1×104。采用E.coli pET表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建PlclpP基因表達(dá)質(zhì)粒pET-28-PlclpP，在E.coli BL21中實(shí)現(xiàn)了重組Pl-ClpP蛋白質(zhì)的表達(dá)。利用組氨酸標(biāo)簽(His-tag)親和純化法，獲得了PlClpP純化蛋白質(zhì)。意外發(fā)現(xiàn)，在E.coli BL21中異源表達(dá)的 PlClpP蛋白質(zhì)在SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)2條帶，分子量分別約為2.1×104和2.5×104。鑒于E.coli EcClpP蛋白酶伴侶分子ClpA或ClpX分別為8.0×104和4.6× 104［9-10］，推測(cè)PlClpP可能與E.coli BL21中未知伴侶分子形成復(fù)合物。未知伴侶分子的序列和功能有待進(jìn)一步的研究。采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)了PlClpP的表達(dá)量，結(jié)果顯示，每1 g濕細(xì)胞可以產(chǎn)生純化的重組PlClpP蛋白質(zhì)復(fù)合物約0.54 mg，占細(xì)胞總蛋白質(zhì)約5.25%。PlClpP復(fù)合物具有ATP-依賴型酪蛋白水解酶活性，最適反應(yīng)溫度為40℃，明顯高于P.lautus CHN26和E.coli BL21的最適生長溫度。此外，終濃度為0.5%的表面活性劑SDS、Tween-20、Tween-80強(qiáng)烈抑制PlClpP復(fù)合物的酶活，而常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對(duì)其活性無抑制作用，表明PlClpP屬于一類非常規(guī)的絲氨酸蛋白酶。

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)PlClpP的表達(dá)及其純化Fig.3 The expression and purification of PlClpP detected by SDS-PAGE

圖4 溫度和pH對(duì)PlClpP復(fù)合物蛋白水解酶活性的影響Fig.4 Effects of the temperature and pH on proteolytic activity of PlClpP complex

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