唐 振，李世杰，王穎飛，夏 凱，侯曉利，張 聰，葉震中，曹紅春

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·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)機(jī)制研究

唐 振，李世杰，王穎飛，夏 凱，侯曉利，張 聰，葉震中，曹紅春

目的 觀察化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法 2013年9月2—21日，利用SPSS統(tǒng)計軟件采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)組、化療減毒湯低劑量組(10 g原生藥/kg)、化療減毒湯中劑量組(20 g原生藥/kg)及化療減毒湯高劑量組(30 g原生藥/kg)，每組10只。對照組給予低蛋白飼料；模型組給予低蛋白飼料并腹腔注射環(huán)磷酰胺；G-CSF組給予低蛋白飼料，腹腔注射環(huán)磷酰胺，皮下注射G-CSF；化療減毒湯低、中、高劑量組給予低蛋白飼料，灌胃化療減毒湯，腹腔注射環(huán)磷酰胺。末次給藥后24 h檢測各組小鼠IL-1α、IL-6水平、造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比及外周血細(xì)胞數(shù)量〔紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)、血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)計數(shù)、血小板(PLT)計數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT)計數(shù)、NEUT分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)計數(shù)、LYMPH分?jǐn)?shù)、單核細(xì)胞(MONO)計數(shù)、MONO分?jǐn)?shù)、嗜堿粒細(xì)胞(BASO)計數(shù)、BASO分?jǐn)?shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EO)計數(shù)、EO分?jǐn)?shù)〕。結(jié)果 模型組IL-1α水平、RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組(P<0.05)；G-CSF組IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、LYMPH分?jǐn)?shù)低于模型組，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組IL-1α水平、RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-1α水平高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-1α水平、WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，IL-1α水平、PLT高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組(P<0.05)。結(jié)論 化療減毒湯中、高劑量具有很好的對抗環(huán)磷酰胺致骨髓抑制作用，在降低環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯優(yōu)于G-CSF，其機(jī)制可能與調(diào)整IL-1α、IL-6水平、降低CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞的百分比有關(guān)。

環(huán)磷酰胺；化療減毒湯；骨髓抑制

唐振，李世杰，王穎飛，等.化療減毒湯對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的保護(hù)機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(27)：3360-3365.[www.chinagp.net]

Tang Z,Li SJ,Wang YF,et al.Protective mechanism of chemotherapy attenuation soup for rats with cyclophosphamide-induced bone marrow suppression[J].Chinese General Practice，2015，18(27)：3360-3365.

化療是目前治療惡性腫瘤的主要方法之一，骨髓抑制是化療最常見的劑量限制性反應(yīng)，外周血象改變是化療藥物對骨髓抑制的主要外周表現(xiàn)[1]，目前臨床上使用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素(IL)11、促紅細(xì)胞生成素等生物制劑對化療后骨髓抑制進(jìn)行對抗；但此類藥物僅能促進(jìn)血象中的一種細(xì)胞恢復(fù)，促進(jìn)短期造血重建干細(xì)胞和較晚的祖細(xì)胞增殖，加之常有發(fā)熱、骨痛等毒副作用，長期大量使用還會刺激惡性細(xì)胞生長并增加白血病患病的風(fēng)險[2]。因此，如何減輕化療藥物對機(jī)體的損傷，特別是對骨髓的抑制，是醫(yī)務(wù)工作者長期以來追求的目標(biāo)?；煖p毒湯是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科李世杰教授總結(jié)出來的中藥復(fù)方，在辨證論治基礎(chǔ)上根據(jù)患者個體情況如舌象、脈相等加減運用，以緩解腫瘤患者化療后骨髓抑制，收效頗佳[3]。為探討其具體機(jī)制，本研究以環(huán)磷酰胺腹腔注射建立小鼠骨髓抑制模型，分別運用低、中、高劑量化療減毒湯和G-CSF進(jìn)行治療，觀察小鼠外周血象變化，計數(shù)小鼠骨髓中造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-c-Kit+Sca-1+lineage marker，CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比[4]，分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖情況，以期從細(xì)胞、分子水平證實本治療方法的科學(xué)性，為臨床治療、新藥研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 化療減毒湯(黃芪60 g、人參30 g、當(dāng)歸20 g、白術(shù)10 g、生甘草10 g、阿膠5 g、龜板膠5 g、鹿角膠5 g，組方中藥物為免煎中藥顆粒，棕黃色，1 g相當(dāng)于原生藥1.292 g)由獲得藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)認(rèn)證的四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司制成、成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院免煎中藥房提供，使用時溶于400 ml煮沸過的飲用水，攪拌使藥液混合均勻。藥液終體積為414 ml，即1.87 g原生藥/ml。本實驗劑量按原生藥g/kg計算。注射用環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號：130105)臨用前配制。G-CSF注射液(齊魯制藥有限公司，批號：201304016TC)。

1.1.2 主要檢測試劑 Anti-Mouse CD34eFluor 660(規(guī)格100 μg，eBioscience)，IL-1α酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒〔批號：C22031492，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司〕，IL-6 ELISA試劑盒〔批號：C30031493，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司〕。

1.1.3 動物 KM雄性小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，動物合格證編號：SCXK(川)2008-19。自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供。本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.1.4 主要儀器 血細(xì)胞分析儀(XT-2000iv，sysmex公司)，流式細(xì)胞儀(navios，Beckman Coulter)，JA1003A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1.1.5 實驗環(huán)境 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)。室內(nèi)溫度20～22 ℃，相對濕度52%左右，24 h明暗交替照明。合格證號SYXK(川)2013-100。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥方法 2013年9月2—21日，利用SPSS統(tǒng)計軟件采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、G-CSF組、化療減毒湯低劑量組(10 g原生藥/kg)、化療減毒湯中劑量組(20 g原生藥/kg)及化療減毒湯高劑量組(30 g原生藥/kg)，每組10只。對照組從第1天給予自制低蛋白飼料(玉米粉+小麥粉)，連續(xù)17 d；模型組給予低蛋白飼料，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，隔天1次，連續(xù)3次；G-CSF組給予低蛋白飼料，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，隔天1次，連續(xù)3次，第14～16天皮下注射G-CSF 50 μg/kg，1次/d，連續(xù)3 d；化療減毒湯低、中、高劑量組給予低蛋白飼料，同時每天上午同一時間灌胃給藥1次(用JA1003A電子天平對小鼠進(jìn)行稱重以確定每只小鼠所需中藥劑量，然后進(jìn)行灌胃給藥)，連續(xù)17 d，從第8天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，連續(xù)3 d。

本文研究價值：

(1)化療減毒湯中、高劑量具有很好的對抗環(huán)磷酰胺致骨髓抑制作用，在降低環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯優(yōu)于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其機(jī)制可能與調(diào)整白介素(IL)1α、IL-6水平，降低造血干細(xì)胞免疫表型(CD34-LSK)細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比有關(guān)。

(2)本方為李世杰教授根據(jù)自己多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)出來的中藥復(fù)方，臨床運用安全有效，適宜長期運用。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比檢測 末次給藥后24 h，尾靜脈取血，采用ELISA法檢測其IL-1α、IL-6水平；處死小鼠，取雙側(cè)股骨，用Anti-Mouse CD34eFluor 660試劑標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測CD34-LSK細(xì)胞數(shù)，并計算各組CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比[4-5]。

1.2.2.2 外周血細(xì)胞數(shù)量檢測 末次給藥后24 h，尾靜脈取血，采用血細(xì)胞分析儀測定其相關(guān)血象：紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)、血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)計數(shù)、血小板(PLT)計數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT)計數(shù)、NEUT分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞(LYMPH)計數(shù)、LYMPH分?jǐn)?shù)、單核細(xì)胞(MONO)計數(shù)、MONO分?jǐn)?shù)、嗜堿粒細(xì)胞(BASO)計數(shù)、BASO分?jǐn)?shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EO)計數(shù)、EO分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比比較 各組IL-1α、IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組IL-1α水平低于對照組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G-CSF組IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組IL-1α水平低于對照組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組IL-1α水平高于模型組和化療減毒湯低劑量組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組IL-1α水平高于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，IL-6水平及CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組、G-CSF組及化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of the levels of IL-1α and IL-6 and the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells among 6 groups

組別IL-1α(pg/ml)IL-6(pg/ml)CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比(%)對照組176±061251±052073±039模型組089±016b371±028b556±284bG-CSF組125±048304±052bc525±173b化療減毒湯低劑量組113±051b324±053bc647±388b化療減毒湯中劑量組179±045ce227±049cde042±017cde化療減毒湯高劑量組172±042cde227±040cde053±017cdeF/Z值6968a1587618251P值<0001<0001<0001

注：G-CSF=重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，IL-1α=白介素1α，IL-6=白介素6，CD34-LSK=造血干細(xì)胞免疫表型；a為Z值；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與G-CSF組比較，dP<0.05；與化療減毒湯低劑量組比較，eP<0.05

2.2 各組外周血細(xì)胞數(shù)量比較 各組RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、MONO、MONO分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組BASO、BASO分?jǐn)?shù)、EO比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G-CSF組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯低劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，PLT高于化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，PLT高于化療減毒湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

3 討論

化療藥物對骨髓的作用主要表現(xiàn)為急性作用和慢性作用，而環(huán)磷酰胺是代表藥物。環(huán)磷酰胺對骨髓的慢性作用主要表現(xiàn)在抑制骨髓干細(xì)胞的功能[5]，而其急性作用則表現(xiàn)為兩方面，一是直接破壞血細(xì)胞，使其數(shù)量迅速降低；二是環(huán)磷酰胺對骨髓造血干細(xì)胞具有一定的動員作用，這種動員作用可導(dǎo)致骨系成骨細(xì)胞(bone-lining osteoblasts)消失或形象改變，導(dǎo)致其功能減退，這些現(xiàn)象與其能夠減少基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、干細(xì)胞因子(SCF)以及血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[6]。而造血干細(xì)胞是血液成分之一，是生成各種血細(xì)胞的最起始細(xì)胞，存在于骨髓、外周血、胚肝中，具有進(jìn)一步分化各系統(tǒng)祖細(xì)胞的能力。CD34抗原選擇地表達(dá)于造血祖細(xì)胞膜上，是造血干細(xì)胞的標(biāo)志[7]。既往實驗研究表明，CD34在造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞上存在，能夠特異性結(jié)合IL-1α、IL-6、IL-3以及G-CSF等細(xì)胞因子的受體[8]。de Revel等[9]將反轉(zhuǎn)錄IL-1α轉(zhuǎn)移到恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使其表達(dá)IL-1α，結(jié)果顯示，IL-1α表達(dá)的同時，G-CSF以及人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)生成顯著增加，其外周血WBC也輕度升高。提示IL-1α有一定刺激骨髓細(xì)胞形成的作用，IL-1α可顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞支持造血作用，這種作用來源于上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-6對造血干細(xì)胞的作用則是多方面的，一方面，IL-6具有刺激造血干細(xì)胞生長、分化和協(xié)同IL-3促進(jìn)造血干細(xì)胞分化和促巨核細(xì)胞成熟等作用；另一方面，IL-6還有促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢的作用。Cardier等[10]用IL-3、IL-6、IL-11和鐵因子共同處理小鼠造血干細(xì)胞24～48 h發(fā)現(xiàn)，這些因子能協(xié)調(diào)并促進(jìn)造血干細(xì)胞向肺癌組織歸巢，遷移率大于對照組，并且轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的比例增加。另外，IL-1、IL-3能聯(lián)合啟動造血干細(xì)胞的早期增殖，而IL-6能阻止這一現(xiàn)象[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-1α水平、RBC、Hb、WBC、PLT、NEUT、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比，提示模型組造模成功，其骨髓干細(xì)胞動員明顯增加，外周血細(xì)胞數(shù)量的變化可能與注射環(huán)磷酰胺后影響IL-1α水平及IL-6水平進(jìn)而引起骨髓造血干細(xì)胞的慢性抑制作用相關(guān)，同文獻(xiàn)報道一致[5]。G-CSF組IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、NEUT分?jǐn)?shù)、MONO分?jǐn)?shù)高于對照組，RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比與模型組無差異，WBC、NEUT分?jǐn)?shù)高于模型組，IL-6水平、LYMPH分?jǐn)?shù)低于模型組，提示G-CSF能夠用于化療后骨髓抑制，能夠刺激骨髓干細(xì)胞動員[12]，但不能從根本上保護(hù)造血干細(xì)胞功能，不適宜長期運用。

表2 各組小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量比較(±s，n=10)

注：RBC=紅細(xì)胞，Hb=血紅蛋白，WBC=白細(xì)胞，PLT=血小板，NEUT=中性粒細(xì)胞，LYMPH=淋巴細(xì)胞，MONO=單核細(xì)胞，BASO=嗜堿粒細(xì)胞，EO=嗜酸粒細(xì)胞；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與G-CSF組比較，dP<0.05；與化療減毒湯低劑量組比較，eP<0.05

本研究結(jié)果顯示，化療減毒湯低劑量組IL-1α水平、RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比高于對照組，IL-6水平低于模型組，LYMPH高于模型組，LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組；化療減毒湯中劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)、EO分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-1α水平高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，WBC、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組，PLT高于化療減毒湯低劑量組；化療減毒湯高劑量組RBC、Hb、LYMPH分?jǐn)?shù)低于對照組，WBC、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)高于對照組，IL-1α水平、WBC、PLT、NEUT、NEUT分?jǐn)?shù)、LYMPH高于模型組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于模型組，IL-1α水平、WBC、LYMPH、LYMPH分?jǐn)?shù)高于G-CSF組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比、MONO分?jǐn)?shù)低于G-CSF組，IL-1α水平、PLT高于化療減毒湯低劑量組，IL-6水平、CD34-LSK細(xì)胞占骨髓細(xì)胞百分比低于化療減毒湯低劑量組。提示化療減毒湯中、高劑量可拮抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的骨髓抑制，具有升高環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制小鼠WBC的作用，且效果優(yōu)于G-CSF，臨床可運用于需行化療或化療后WBC降低的患者。其機(jī)理可能是其通過增加實驗小鼠血液中的IL-1α水平，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞支持造血干細(xì)胞的分化及增殖功能，促進(jìn)其造血干細(xì)胞功能及外周血象的恢復(fù)；同時通過降低其IL-6水平，導(dǎo)致造血干細(xì)胞歸巢的作用、減弱IL-6抑制其他細(xì)胞因子對造血干細(xì)胞功能的抑制作用，這幾方面的綜合結(jié)果導(dǎo)致化療減毒湯在不損傷造血干細(xì)胞儲備的情況下，將外周血象維持在較高水平。

根據(jù)化療后骨髓抑制常見的乏力、頭暈、發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”“血虛”范疇。化療后脾腎受損，脾虛則氣血生化乏源，腎虧則精血生化無根，基于陰陽互根、五臟相關(guān)、氣血同源等理論，氣虛不能生血，血虛不能化氣，氣虛者陽漸衰，血虛者陰漸虧，終致脾腎不足，氣血兩虧[13]?！稄埵厢t(yī)通》[14]有云：“人之虛，非氣即血，五臟六腑莫能外焉。而血之源頭在乎腎，氣之源頭在乎脾。”可見化療骨髓抑制患者的關(guān)鍵病理機(jī)制是脾腎不足，故治療應(yīng)從脾腎入手?；熃舛緶侵委熁熀蠊撬枰种频慕?jīng)驗方，方中黃芪、人參大補元氣，健脾益氣為君，當(dāng)歸補血活血、白術(shù)健脾益氣，使補而不滯為丞，佐以阿膠、鹿角膠、龜板膠補血益精滋腎，甘草調(diào)和諸藥，共奏健脾益腎，補氣益血之功。趙靜梅[15]研究表明，補氣、養(yǎng)血、益腎之法具有解除化療后骨髓細(xì)胞G1期阻滯的作用，能增加造血干祖細(xì)胞的數(shù)量，對骨髓有核細(xì)胞計數(shù)及紅系、粒系、巨系等的恢復(fù)具有較好作用。補腎解毒活血中藥可通過促進(jìn)骨髓造血祖細(xì)胞集落生成能力，促進(jìn)造血細(xì)胞的生成[16-17]。本研究所采用的化療減毒湯方中人參所含的多糖、皂甙可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造血細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)[18]；黃芪具有減輕貧血動物模型的貧血程度、促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和分化的作用，當(dāng)歸多糖可進(jìn)而促進(jìn)粒單系血細(xì)胞的生成[19]；阿膠活性組分能夠有效地保護(hù)骨髓造血微環(huán)境，減輕環(huán)磷酰胺對骨髓組織的損傷，保護(hù)造血組織[20]；白術(shù)有抗腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并可調(diào)節(jié)腫瘤患者胃腸功能[21]。

顯然，本研究也存在一定的不足之處。首先，本研究未能完全揭示化療減毒湯中、高劑量升高外周血WBC、PLT的具體機(jī)制，也未能揭示本方升高外周血WBC、PLT的最佳劑量及最佳時機(jī)；其次，本研究樣本量仍偏小，實驗時間較短，今后如能開展針對療效機(jī)制、量效機(jī)制的多中心、大樣本、隨訪時間較長的基礎(chǔ)研究、臨床隊列研究可望得到更有說服力的結(jié)果。

綜上所述，化療減毒湯能改善環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓抑制，在骨髓造血干細(xì)胞慢性毒性方面，化療減毒湯明顯優(yōu)于G-CSF，值得推廣。但其詳細(xì)作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步深入研究。

[1]程凱,蔣剛.91例化學(xué)治療藥物致Ⅳ度骨髓抑制臨床分析[J].中國藥業(yè),2014,23(12):50-51.

[2]Relling MV,Boyett JM,Blanco JG,et al.Granulocyte colony-stimulating factor and the risk of secondary myeloid malignancy after etoposide treatment[J].Blood,2003,101(10):3862-3867.

[3]譚雪芹,李世杰,何秀云.李世杰教授自擬化療減毒方臨床經(jīng)驗總結(jié)[J].光明中醫(yī),2013,28(1):2012-2014.

[4]Tian C.Recent research advances on markers,isolation and purification of mouse hematopoietic stem cells-review[J].Journal of Experimental Hematology,2012,20(1):196-199.(in Chinese) 田晨.小鼠造血干細(xì)胞表型及其分離純化的研究進(jìn)展[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2012,20(1):196-199.

[5]Tian J,Yu P,Sun WX,et al.Effect of cyclophosphamide on murine bone marrow hematopoietic cells and its possible mechanism[J].Journal of Experimental Hematology,2012,20(6):1316-1321.(in Chinese) 田杰,于沛,孫文宣,等.環(huán)磷酰胺對正常小鼠骨髓造血細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2012,20(6):1316-1321.

[6]McKinstry WJ,Li CL,Rasko JE,et al.Cytokine receptor expression on hematopoietic stem and progenitor cells[J].Blood,1997,89(1):65-71.

[7]Zhou J,Zhu B,Du HY,et al.Detection and analysis of CD271,CD133and CD34expression in bone marrow cells by flow cytometry with three color flouresence labelling[J].Journal of Experimental Hematology,2009,17(1):133-136.(in Chinese) 周俊,朱兵,杜海燕,等.流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測骨髓細(xì)胞CD271、CD133、CD34的表達(dá)與分析[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2009,17(1):133-136.

[8]Mayack SR,Wagers AJ.Osteolineage niche cells initiate hematopoietic stem cell mobilization[J].Blood,2008,112(3):519-531.

[9]de Revel T,Becard N,Sorg T,et al.Retroviral interleukin 1alpha gene transfer in bone marrow stromal cells in a primate model:induction of myelopoiesis stimulation[J].Br J Haematol,2002,118(3):875-884.

[10]Cardier JE,Murphy MJ Jr,Erickson-Miller CL.IL-6 interferes with stimulation of HPP-CFC and large CFU-Mk in conjunction with cytokine combinations from primitive murine marrow cells[J].Stem Cells,1997,15(6):437-442.

[11]Yang Q,Zhang LF.Interleukin family cytokines and stem cell mobilization[J].Chines Journal of Comparative Medicine,2011,21(5):62-65.(in Chinese) 楊青,張連峰.白介素家族細(xì)胞因子與干細(xì)胞動員[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(5):62-65.

[12]Xu L,Chang CK,Gan WJ,et al.Yield of CD34+cells in graft can be increased significantly by G-CSF used at appropriate time after chemotherapy for Auto PBSCT[J].Journal of Experimental Hematology,2011,19(3):759-763.(in Chinese) 徐黎,常春康,干蔚瑾,等.化療后恰當(dāng)時機(jī)使用G-CSF能顯著提高自體外周血干細(xì)胞移植物中CD34+細(xì)胞的含量[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2011,19(3):759-763.

[13]Lin CJ,Gan XJ.Experience on treating arrest of bone marrow after chemotherapy with self-made SanZi BuXueTang[J].Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2012,25(10):47-48.(in Chinese) 藺彩娟,甘欣錦.自擬三子補血湯治療化療后骨髓抑制的經(jīng)驗[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(10):47-48.

[14]張璐.張氏醫(yī)通[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2006,卷二:33.

[15]趙靜梅.補腎活血法和益氣補血法防治化療后骨髓抑制及作用機(jī)制比較研究[D].北京:中國人民解放軍學(xué)院,2012:1-4.

[16]Wang Q,Yang XH,Gao Y,et al.A comparative study of Bushen Jiedu Huoxue recipe and Yiqi Buxue recipe on the impact of hematopoiesis in marrow-depressed mice[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2012,18(1):192-195.(in Chinese) 王茜,楊旭輝,高月,等.補腎解毒活血法與益氣補血法對骨髓抑制小鼠造血功能影響的比較研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(1):192-195.

[17]Wang Q,Yang XH,Gao Y,et al.A comparative study of Bushen Jiedu Huoxue recipe and Yiqi Buxue recipe on the prevention of bone marrow suppression induced by cyclophosphamide[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2012,18(7):242-245.(in Chinese) 王茜,楊旭輝,高月,等.補腎解毒活血方與益氣補血方預(yù)防化療后骨髓抑制的比較研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(7):242-245.

[18]Wei JA,Cheng ZA,Wen JX,et al.Compative study of enhencing effect on mRNA of hematopoietic growth factors in rat bone marrow mesenchymal stem cells by ginseng polysaccharide and ginsenoside[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2011,31(3):372-375.(in Chinese) 危建安,程志安,溫建炫,等.人參多糖與人參皂苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造血細(xì)胞因子表達(dá)的作用比較[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,31(3):372-375.

[19]沈云輝,陳長勛.中藥有效組分促粒系造血及升高白細(xì)胞作用的研究[J].中成藥,2005,27(4):462-464.

[20]鄧皖利,吳宏忠,徐文,等.阿膠補血活性組分對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠骨髓造血微環(huán)境的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(10):2542-2544.

[21]Xiang XQ,Ye H.Progress of research and application in tumors of atractylodes macrocephala koidz[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2013,19(8):367-370.(in Chinese) 向小慶,葉紅.白術(shù)抗腫瘤作用的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(8):367-370.

(本文編輯：崔麗紅)

Protective Mechanism of Chemotherapy Attenuation Soup for Rats With Cyclophosphamide-induced Bone Marrow Suppression

TANGZhen,LIShi-jie,WANGYing-fei,etal.

SchoolofClinicalMedicine,ChengduUniversityofT.C.M,Chengdu610072,China

Objective To observe the protective mechanism of chemotherapy attenuation soup for rats with cyclophosphamide-induced bone marrow suppression.Methods From September 2 to 21 in 2013,using SPSS statistic software,60 rats were equally divided into 6 groups:control group,model group,G-CSF group,low-dose chemotherapy attenuation soup group (10 g crude drug/kg),medium-dose chemotherapy attenuation soup group (20 g crude drug/kg) and high-dose chemotherapy attenuation soup group (30 g crude drug/kg).Control group was given low protein feed;model group was given low protein feed and cyclophosphamide by intraperitoneal injection;G-CSF group was given low protein feed,cyclophosphamide by intraperitoneal injection and G-CSF by subcutaneous injection;low-dose chemotherapy attenuation soup group,medium-dose chemotherapy attenuation soup group and high-dose chemotherapy attenuation soup group were given low protein feed,chemotherapy attenuation soup by gavage and cyclophosphamide by intraperitoneal injection.24 hours after the last drug administration,examined levels of IL-1α and IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells,RBC,Hb,WBC,PLT,NEUT,NEUT score,LYMPH,LYMPH score,MONO,MONO score,BASO,BASO score,EO and EO score.Results Model group was lower(P<0.05) in the level of IL-1α,RBC,Hb,WBC，PLT,NEUT,LYMPH,LYMPH score,EO score and higher (P<0.05) in the level of IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than control group;G-CSF group was higher (P<0.05) in the level of IL-6,the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells,NEUT score and MONO score and higher (P<0.05) in RBC,Hb，LYMPH score and EO score than control group;G-CSF group was lower(P<0.05) in the level of IL-6 and LYMPH score and higher (P<0.05) in WBC and NEUT score than model group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-1α,RBC,Hb,LYMPH score and EO score and higher (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than control group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-6 and higher (P<0.05) in LYMPH than model group;low-dose chemotherapy attenuation soup group was higher(P<0.05) in LYMPH score than G-CSF group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in RBC,Hb,LYMPH score and EO score and higher (P<0.05) in WBC,NEUT and NEUT score than control group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,PLT,NEUT,NEUT score and LYMPH and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than model group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells and MONO score and higher (P<0.05) in WBC and LYMPH score than G-CSF group;medium-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than low-dose chemotherapy attenuation soup group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was lower (P<0.05) in RBC,Hb and LYMPH score and higher (P<0.05) in WBC,NEUT score than control group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,PLT,NEUT,NEUT score and LYMPH and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than model group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α,WBC,LYMPH and LYMPH score and lower (P<0.05) in the level of IL-6,percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells and MONO score than G-CSF group;high-dose chemotherapy attenuation soup group was higher (P<0.05) in the level of IL-1α and PLT and lower (P<0.05) in the level of IL-6 and percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells than low-dose chemotherapy attenuation soup group.Conclusion Medium-dose and high-dose chemotherapy attenuation soup have good protective effect against bone marrow suppression induced by cyclophosphamide.Chemotherapy attenuation soup is superior to G-CSF in reducing the chronic toxicity brought by cyclophosphamide in bone marrow hematopoietic stem cells.The mechanism is probably that it can adjust IL-1α and IL-6 levels and reduce the percentage of CD34-LSK cells in bone marrow cells.

Cyclophosphamide;Chemotherapy attenuation soup;Bone marrow suppression

四川省科技支撐計劃項目(2011SZ0312)

610072 四川省成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(唐振，王穎飛，夏凱，侯曉利，張聰，葉震中，曹紅春)；成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(李世杰)

李世杰，610072 四川省成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；E-mail：chinajef@126.com

R 551.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.27.022

2015-02-25；

2015-05-15)