張娟娟，劉宗霞，孫　巖(濰坊醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，山東濰坊261053)

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轉(zhuǎn)錄因子c-Jun調(diào)控成骨細(xì)胞Mepe基因表達(dá)的研究*

張娟娟，劉宗霞，孫巖△
(濰坊醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，山東濰坊261053)

［摘要］目的:探討轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對Mepe基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并尋找c-Jun在Mepe啟動(dòng)子上的特異性結(jié)合位點(diǎn)。方法:利用免疫組織化學(xué)方法定位c-Jun與Mepe在小鼠骨組織的表達(dá);采用real-time PCR的方法檢測c-Jun的表達(dá)量改變對Mepe mRNA表達(dá)的影響;應(yīng)用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)及定點(diǎn)突變技術(shù)分析c-Jun對Mepe基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果:轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在小鼠骨細(xì)胞胞核中呈陽性表達(dá)，而Mepe在小鼠骨細(xì)胞的胞漿中有表達(dá); real-time PCR顯示c-Jun過表達(dá)后，Mepe mRNA的表達(dá)顯著增加(P＜0.05) ;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測顯示，在成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCMV-3Tag-1-c-Jun的實(shí)驗(yàn)組Mepe啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性升高(P＜0.05) ;定點(diǎn)突變c-Jun的潛在結(jié)合位點(diǎn)后，Mepe啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降(P＜0.05)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子c-Jun可通過Mepe啟動(dòng)子上潛在的c-Jun結(jié)合位點(diǎn)上調(diào)成骨細(xì)胞中該基因的轉(zhuǎn)錄。

［關(guān)鍵詞］轉(zhuǎn)錄因子c-Jun;細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白;成骨細(xì)胞

［修回日期］2015-01-26

Transcriptional factor c-Jun regulates Mepe gene expression in osteoblasts

ZHANG Juan-juan，LIU Zong-xia，SUN Yan
(Institute of Stomatology，School of Dental Medicine，Weifang Medical University，Weifang 261053，China.E-mail: yansw2005 @ aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the relationship between transcriptional factor c-Jun and Mepe gene expression，and to identify the specific binding site of c-Jun on the promoter of Mepe.METHODS: The expression of c-Jun and Mepe in mouse bone tissue was detected by immunolocalization assay.The mRNA expression of Mepe was determined by real-time PCR when the expression of c-Jun was changed.The techniques of dual luciferase analysis and site-specific mutagenesis were used to measure the effects of c-Jun on the transcriptional activity of Mepe.RESULTS: c-Jun was detected in the nucleus of osteocytes，while Mepe was observed in osteocyte cytoplasm.The results of real-time PCR showed that overexpression of c-Jun directly resulted in significantly higher up-regulation of Mepe mRNA.Compared with control group，the transcriptional activity of Mepe promoter was increased in osteoblasts which was transfected with pCMV-3Tag-1-c-Jun.Mutation of c-Jun potential binding sites decreased the transcriptional activity of Mepe promoter.CONCLUSION: Mepe gene transcription can be up-regulated by c-Jun which binds to the specific sites of Mepe promoter in osteoblasts.

［KEY WORDS］Transcription factor c-Jun; Matrix extracellular phosphoglycoprotein; Osteoblasts

2000年，Rowe等［1］對大鼠骨相關(guān)腫瘤基因進(jìn)行篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)明顯差異表達(dá)的新基因，即細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，Mepe)。Mepe蛋白主要在礦化的成骨細(xì)胞中表達(dá)，與骨骼及牙的形成和發(fā)育密切相關(guān)，同時(shí)也是調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酸鹽平衡的重要生物分子［2］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Mepe在成骨細(xì)胞分化與骨發(fā)育再生、牙髓干細(xì)胞增殖分化、參與細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答、凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，逐漸成為研究熱點(diǎn)。

激活劑蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是一類立早基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子，其組成成員包括c-Fos家族的c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2與c-Jun家族的c-Jun、JunB、JunD，它們是成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和牙源性細(xì)胞株所必須的轉(zhuǎn)錄因子。c-Jun在細(xì)胞的正常生長、癌性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用［3］。本研究通過觀察c-Jun對Mepe基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，為進(jìn)一步研究AP-1家族調(diào)控成骨細(xì)胞發(fā)育及骨相關(guān)疾病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1動(dòng)物

成年昆明小鼠，雌雄不限，40～50 g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2主要試劑

兔抗鼠c-Jun和Mepe多克隆抗體(Abcam) ;鼠ABC免疫組化檢測試劑盒(vector) ; DAB顯色試劑盒(北京中山金橋) ;小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司) ; pMD18-T Simple Vector、T4 DNA Ligase、Prime STAR HS DNA Polymerase、RNAiso Plus、Prime-ScriptRT reagent Kit、MutanBEST Kit(TaKaRa) ; HindⅢ、Xho I、EcoRⅡ、XhoⅡ限制性內(nèi)切酶、Trans-FastTMTransfection Reagent和Dual-Luciferase雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega) ;α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(HyClone) ;胎牛血清(杭州四季青公司) ;引物合成及測序由TaKaRa完成。

3主要方法

3.1免疫組化法檢測c-Jun和Mepe在小鼠下頜骨中的表達(dá)取出生后5 d的小鼠脫頸處死，分離下頜骨，立即置于4%的中性甲醛溶液中4℃固定16 h，經(jīng)10% EDTA(pH 8.0)溶液4℃脫礦7 d，常規(guī)制作石蠟切片。組織切片常規(guī)脫蠟入水，0.01 mol/L檸檬酸鈉(pH 6.0) 95℃處理40 min抗原修復(fù)，3% H2O2/甲醇去除內(nèi)源性過氧化物酶活性; 1∶50羊血清37℃、30 min封閉非特異結(jié)合蛋白，滴加1∶20的兔抗鼠c-Jun或MepeⅠ抗，4℃孵育過夜;滴加1∶200 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫結(jié)合2 h;加AB液，37℃孵育30 min，DAB顯色，常規(guī)封片，陰性對照組以PBS代替Ⅰ抗，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。以細(xì)胞深染成顆粒狀棕黃色為陽性表達(dá)。

3.3 Real-time PCR檢測過量表達(dá)和RNA干擾c-jun 對Mepe mRNA表達(dá)的影響根據(jù)Ambion提供的在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設(shè)計(jì)用于干擾c-jun表達(dá)的siRNA-c-Jun，其正義鏈為5’-CAGAGCAUGACCUUGAACCTT-3’，反義鏈為5’-GGUUCAAGGUCAUGCUCUGTT-3’，由TaKaRa合成。用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞傳至5代以上，細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)2×109cells/L時(shí)鋪6孔板，細(xì)胞豐度為70%～80%時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作步驟參照TransFastTMTransfection Reagent說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染100 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或siRNA-c-Jun，對照組轉(zhuǎn)染100ng pCMV-3Tag-1或siRNA-control，過表達(dá)組轉(zhuǎn)染24 h，RNA干擾組轉(zhuǎn)染36 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測c-Jun和Mepe mRNA表達(dá)的變化(引物序列見表1)。反應(yīng)條件為94℃4 min;94℃10 s，60℃15 s，72℃25 s，80℃15 s，40個(gè)循環(huán);72℃5 min。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。Ct值由IQ5TMPCR儀自動(dòng)讀出，結(jié)果進(jìn)行2－ΔΔ Ct分析。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

3.4雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測c-Jun過表達(dá)對不同長度Mepe基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性影響成骨細(xì)胞按6×107/m2接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用50 ng重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-1-c-Jun轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞，以pCMV-3Tag-1作為陰性對照，pRL-TK作為內(nèi)參照。本實(shí)驗(yàn)共分5組，每組3個(gè)復(fù)孔。每組分別加入不同長度Mepe基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒pGL3-Mepe-P-121-+ 23 (144 bp)、pGL3-Mepe-P-183-+ 23(206 bp)、pGL3-Mepe-P-343-+ 23 (366 bp)、pGL3-Mepe-P-543-+ 23 (566 bp)、pGL3-Mepe-P-1124-+23(1 147 bp)各300 ng(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。轉(zhuǎn)染后無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，補(bǔ)加含有胎牛血清的培養(yǎng)液至500 μL繼續(xù)轉(zhuǎn)染30 h后收板，進(jìn)行螢光素酶活性檢測。參照Dual-Luciferase雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega)說明書進(jìn)行檢測: PBS洗滌細(xì)胞后，每孔加入100 μL PLB裂解15 min，取20 μL細(xì)胞裂解液加入50 μL LARⅡ混勻后立即檢測螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)發(fā)光的數(shù)值(U1)。之后加入50 μL Stop＆GloTM試劑混勻，立即檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase)發(fā)光的數(shù)值(U2)。樣品U1/U2之值即為報(bào)告基因的螢光素酶相對活性，每個(gè)樣品的3組數(shù)據(jù)取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.5 Mepe基因啟動(dòng)子上c-Jun結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變及其突變體的構(gòu)建利用生物信息工具，對Mepe基因上游啟動(dòng)子序列－3 126/+ 198區(qū)域進(jìn)行調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)c-Jun的2個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物(表1)，由TaKaRa合成，以實(shí)驗(yàn)室的重組質(zhì)粒pMD18-T Simple-Mepe-566為模板，按照TaKaRa MutanBEST Kit說明書進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變體pMD18-T Simple-Mepe-566mut。用Xho I和HindⅢ雙酶切后再亞克隆到pGL3-Basic載體中，并送TaKaRa公司測序鑒定。構(gòu)建成功的螢光素酶表達(dá)載體突變體命名為pGL3-Mepe-566mut1、pGL3-Mepe-566mut2和pGL3-Mepe-566mut(2個(gè)位點(diǎn)均突變)，同時(shí)將野生型PGL3-Mepe-566命名為PGL3-Mepe-566WT。

3.6螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子c-Jun過表達(dá)時(shí)對野生型和突變型Mepe基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響將重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-1-c-Jun瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞，空質(zhì)粒pCMV-3Tag-1作為陰性對照，pRL40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將實(shí)驗(yàn)分為5組: Basic組:300 ng pGL3-Basic+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; WT組:300 ng pGL3-Mepe-566WT+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut1組: 300 ng pGL3-Mepe-566mut1+ 200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut2組:300 ng pGL3-Mepe-566mut2+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut組: 300 ng pGL3-Mepe-566mut+ 200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1。每組3個(gè)復(fù)孔，相同條件下重復(fù)3次，用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對RT-PCR結(jié)果用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 c-Jun與Mepe在小鼠下頜骨中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，作為轉(zhuǎn)錄因子的c-Jun在出生后5 d小鼠頜骨的成骨細(xì)胞胞核中呈陽性表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在成釉細(xì)胞的胞核中也呈陽性表達(dá)，Mepe在小鼠成骨細(xì)胞的胞漿中有表達(dá)，尤其在嵌入骨陷窩中的鈣化骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量高，以PBS代替Ⅰ抗的對照組呈陰性，見圖1。

Figure 1.The expression of c-Jun and Mepe in the mouse jawbone detected by immunohistochemistry.A: c-Jun was detected in the nucleus of osteocytes (×200) ; B: Mepe was observed in osteocyte cytoplasm (×400).圖1免疫組織化學(xué)染色顯示c-Jun和Mepe在小鼠頜骨中的表達(dá)

2小鼠c-jun基因的克隆及重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-1-c-Jun的構(gòu)建及鑒定

小鼠c-jun基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增的條帶大小與目的片段大小一致(1 005 bp) ;重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-1-c-Jun經(jīng)EcoRⅡ和XhoⅡ分別單酶切鑒定，得到大小分別為248 bp、4 957 bp與555 bp、4 650 bp的條帶，與預(yù)測結(jié)果一致，見圖2;初步鑒定正確的重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-1-c-Jun由TaKaRa公司測序分析，并進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示所得基因序列與GenBank中小鼠c-jun基因序列完全一致，無堿基的點(diǎn)突變及移碼發(fā)生。

3 c-jun的RNA干擾及過表達(dá)對Mepe基因表達(dá)的影響

成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Jun siRNA 36 h后，real-time PCR檢測結(jié)果表明，c-Jun mRNA表達(dá)水平下降約80%，差異顯著(P＜0.05)，說明沉默效果較好。Mepe mRNA在c-Jun siRNA組表達(dá)水平下降約75%，而在轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體pCMV-3Tag-1-c-Jun組表達(dá)水平上升約5倍，差異顯著(P＜0.05)，這表明轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在調(diào)控小鼠Mepe轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用，見圖3。

Figure 2.Gene clone of c-jun and construction of overexpression vector pCMV-3Tag-1-c-Jun.A: the PCR result of c-Jun; B: enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun.1: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun digested by XhoⅡ(4 650 bp and 555 bp fragments) ; 2: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun digested by EcoRⅡ(4 957 bp and 248 bp fragments) ; 3: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun without digestion.圖2 c-jun基因的克隆及過表達(dá)載體pCMV-3Tag-1-c-Jun的構(gòu)建

Figure 3.The mRNA expression of c-Jun and Mepe detected by real-time PCR.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control siRNA group;#P＜0.05 vs pCMV-3Tag-1 group.圖3 Real-time PCR檢測c-Jun和Mepe mRNA的表達(dá)變化

4 c-Jun對不同長度小鼠Mepe基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

將轉(zhuǎn)錄因子c-Jun過表達(dá)載體pCMV-3Tag-1-c-Jun與不同長度的Mepe基因啟動(dòng)子pGL3-Mepe共轉(zhuǎn)染30 h后，收集細(xì)胞檢測螢光素酶活性。結(jié)果顯示過表達(dá)c-Jun明顯上調(diào)Mepe啟動(dòng)子的螢光素酶活性(P＜0.05)，并且對pGL3-Mepe-144與pGL3-Mepe-566上調(diào)幅度均較大(P＜0.05)，兩者之間差異無顯著性(P＞0.05)。由此推斷Mepe啟動(dòng)子－121～+23與－543～－343區(qū)域存在c-Jun的特異性結(jié)合位點(diǎn)，可上調(diào)Mepe的轉(zhuǎn)錄，見圖4。

5 Mepe基因啟動(dòng)子特征性序列定點(diǎn)突變體的構(gòu)建及鑒定

通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析找到Mepe基因啟動(dòng)子－105/－99與－491/－486區(qū)域存在潛在的2 個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。根據(jù)設(shè)計(jì)的基因突變引物，以pMD18-T Simple-Mepe-566為模板，將特征性序列1的ACTGAGT突變?yōu)锳CTTCGT，特征性序列2 的ACTCAC突變?yōu)锳CGTAC，構(gòu)建Mepe基因突變體真核表達(dá)載體pGL3-Mepe-566mut1、pGL3-Mepe-566mut2和pGL3－Mepe-566mut(2個(gè)位點(diǎn)均突變)。突變體質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確，由TaKaRa公司序列分析，并進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示Mepe基因啟動(dòng)子在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生突變，見圖5。

6 c-Jun對野生型和突變型Mepe基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

雙螢光素酶檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體c-Jun后，pGL3-Mepe-566WT的螢光素酶活性上升約2 倍(P＜0.05)，pGL3-Mepe-566mut1與pGL3-Mepe-566mut2的螢光素酶活性上升約1倍(P＜0.05)，pGL3-Mepe-566mut的熒螢素酶活性無顯著變化(P＞0.05)，與pGL3-Mepe-566WT相比較pGL3-Mepe-566mut1與pGL3-Mepe-566mut2的螢光素酶活性均下降了約40% (P＜0.05)，而pGL3-Mepe-566mut的螢光素酶活性下降了約75% (P＜0.05)，這證明了轉(zhuǎn)錄因子c-Jun可通過與Mepe基因啟動(dòng)子的特征性序列ACTGAGT與ACTCAC這2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)相互作用，調(diào)控Mepe基因的表達(dá)，見圖6。

Figure 4.The change of Mepe promoter relative luciferase activities after transfected with pCMV-3Tag-1-c-Jun.Mean ±SD.n=9.*P＜0.05 vs pCMV-3Tag-1 group.圖4成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-3Tag-1-c-Jun對不同長度Mepe基因啟動(dòng)子螢光素酶活性的影響

Figure 5.The schematic diagram for two potential c-Jun-binding sites in Mepe promoter (A) and the results of sequencing identification for recombinant plasmid pGL3-Mepe-566mut1 (B) and pGL3-Mepe-566mut2 (C).圖5 Mepe基因啟動(dòng)子上潛在的2個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)示意圖及重組質(zhì)粒pGL3-Mepe-566mut1和pGL3-Mepe-566mut2的測序鑒定結(jié)果

討論

Mepe是短整聯(lián)蛋白黏合性配體互動(dòng)糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycolproteins，SIBLINGs)蛋白家族的新成員，又名成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞因子45(osteoblast/osteocyte factor 45，OF45)或osteoregulin，主要表達(dá)于骨組織、牙齒組織及腎近球小管中，與體內(nèi)鈣磷平衡及牙體硬組織的形成礦化密切相關(guān)［4-6］。小鼠Mepe基因與人類此基因在蛋白水平上具有44%的同一性和54%的相似性，都含有信號肽、RGD元件、SGDG元件以及ASARM元件;二者cDNA序列具有74%～79%的同一性。Mepe蛋白調(diào)節(jié)鈣磷酸鹽代謝功能以及成骨細(xì)胞的分化方面具有雙重性［7］。最近的研究表明Mepe中不同的結(jié)構(gòu)域?qū)ΦV化起不同的作用，ASARM片段可以抑制鈣化，而AC100片段則促進(jìn)鈣化［8-9］。Mepe過表達(dá)小鼠表現(xiàn)為骨形成和礦化減少，但是破骨細(xì)胞數(shù)目和活性卻是降低的。Nagel等［10］在體外實(shí)驗(yàn)中觀察到Mepe 和AC-100均能有效促進(jìn)前成骨細(xì)胞的合成代謝，從而刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化。

原癌基因c-jun和c-fos是AP-1家族成員，其蛋白編碼產(chǎn)物能通過亮氨酸拉鏈形成同源二聚體或異源二聚體，與許多基因的啟動(dòng)子上AP-1特征性序列結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖和凋亡［11-12］。已知的受AP-1調(diào)控的骨特異性基因有骨鈣素、Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶等。c-Jun和c-Fos直接影響著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能穩(wěn)定［13-14］。研究證實(shí)c-Fos不表達(dá)或過表達(dá)均可導(dǎo)致骨發(fā)育異常［15］，提示c-Fos在骨形成和調(diào)控成骨細(xì)胞特異基因的表達(dá)中具有重要作用。c-jun編碼產(chǎn)物為核內(nèi)F78結(jié)合蛋白，是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖分化的基因之一，在成骨細(xì)胞增殖期高度表達(dá)，分化期低表達(dá)或無表達(dá)［16］。

目前關(guān)于c-Jun和Mepe的關(guān)系目前還尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)對成骨細(xì)胞中c-Jun在Mepe基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)首先通過免疫組化的方法觀察到小鼠成骨細(xì)胞胞核中有c-Jun的表達(dá)，Mepe在小鼠成骨細(xì)胞的胞漿中有表達(dá)，尤其在嵌入骨陷窩中的鈣化骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量高，這為進(jìn)行下一步深入的研究提供了依據(jù)。通過過量表達(dá)和基因沉默c-jun的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Mepe的mRNA表達(dá)隨c-Jun表達(dá)量的變化而變化，這表明c-Jun很可能參與了調(diào)控Mepe在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，并且具有能夠上調(diào)Mepe基因表達(dá)的重要作用。共轉(zhuǎn)染c-Jun過表達(dá)載體pCMV-3Tag-1-c-Jun與不同長度的Mepe基因啟動(dòng)子后，通過螢光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Jun明顯上調(diào)Mepe啟動(dòng)子的螢光素酶活性，并且對Mepe啟動(dòng)子144 bp與566 bp上調(diào)幅度均較大。進(jìn)一步通過對Mepe啟動(dòng)子近端區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析顯示，在－105/－99與－491/－486區(qū)域存在2個(gè)可能的c-Jun結(jié)合位點(diǎn)，對這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)潛在的c-Jun結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)或同時(shí)突變均能顯著能降低Mepe啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，這表明c-Jun可能是通過直接與特異性結(jié)合位點(diǎn)ACTGAGT與ACTCAC結(jié)合來調(diào)控Mepe基因的轉(zhuǎn)錄。

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通訊作者△Tel: 0536-8462451; E-mail: yansw2005@ aliyun.com

*［基金項(xiàng)目］山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2012HQ036) ;山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2013HQ019) ;山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.J12LL51)

［收稿日期］2014-12-09

［文章編號］1000-4718(2015)06-1026-06

［中圖分類號］R336

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.011