盧　歡，鄭曉春，陳小琳，吳希珠，鄭官林

(1福建省婦幼保健院麻醉科，2福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院，3福建省立醫(yī)院麻醉科，福建福州350001)

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母體肢體缺血預(yù)處理對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響*

盧歡1，2，鄭曉春2，3△，陳小琳1，吳希珠1，2，鄭官林1，2

(1福建省婦幼保健院麻醉科，2福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院，3福建省立醫(yī)院麻醉科，福建福州350001)

［摘要］目的:探索母體肢體缺血預(yù)處理(LIP)對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法:將孕20 d的40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、LIP對(duì)照組、胎鼠宮內(nèi)窘迫組(FD組)和LIP+ FD組。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立胎鼠宮內(nèi)窘迫模型，觀察各組胎鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化;檢測(cè)海馬線粒體跨膜電位變化;測(cè)定海馬組織活性氧簇(ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、丙二醛(MDA)含量及錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性變化。結(jié)果: (1)與S組比較，F(xiàn)D組和LIP+ FD組電鏡下觀察胎鼠海馬CA1區(qū)線粒體呈不同程度破壞，線粒體膜電位下降，ATP含量和Mn-SOD活性降低，ROS和MDA含量增加(P＜0.05)。(2)與FD組比較，LIP+ FD組胎鼠海馬CA1區(qū)線粒體的超微結(jié)構(gòu)保持較好的完整性，線粒體膜電位明顯提高，海馬ATP含量和Mn-SOD活性顯著增高，ROS和MDA含量減少(P＜0.05)。結(jié)論:母體肢體缺血預(yù)處理對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元線粒體功能具有保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］肢體缺血預(yù)處理;胎兒缺氧/復(fù)氧損傷;線粒體

［修回日期］2015-04-22

Effects of maternal limb ischemic preconditioning on structural and functional changes of mitochondria in fetal hippocampal neurons induced by intrauterine distress-reoxygenation in rats

LU Huan1，2，ZHENG Xiao-chun2，3，CHEN Xiao-lin1，WU Xi-zhu1，2，ZHENG Guan-lin1，2
(1Department of Anesthesiology，F(xiàn)ujian Maternity and Children Health Hospital，2Provincial Clinical Medical College，F(xiàn)ujian Medical University，3Department of Anesthesiology，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China.E-mail: zhengxc2@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on the mitochondrial structures and functions of the hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.METHODS: Pregnant rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: sham (S) group，LIP group，fetal distress (FD) group and LIP+ FD group.Intrauterine ischemia model was established through the experimental design.The ultrastructure of the mitochondria in CA1 area of the hippocampus was observed.The mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) were measured.The content of ATP and MDA in the hippocampus tissue was detected.The activity of Mn-SOD was observed.RESULTS: Compared with sham group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was damaged in FD group and LIP+ FD group.The mitochondrial membrane potential，the content of ATP and the activity of Mn-SOD were decreased.However，the content of ROS and MDA was increased.Compared with FD group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was intact in LIP+ FD group.Furthermore，the reduced mitochondrial membrane potential and ATP content were inhibited.The activity of Mn-SOD was increased，but the content of ROS and MDA was decreased in LIP+ FD group.CONCLUSION: Limb ischemia preconditioning inhibits the damage the mitochondria of fetal hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.

［KEY WORDS］Limb ischemia preconditioning; Fetal hypoxia/reoxygenation injury; Mitochondria

胎兒宮內(nèi)窘迫是胎兒圍產(chǎn)期死亡及新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的常見(jiàn)原因，嚴(yán)重威脅圍產(chǎn)兒的健康［1］。胎兒宮內(nèi)窘迫后應(yīng)盡快恢復(fù)胎兒血流灌注，這缺氧/復(fù)氧過(guò)程對(duì)胎兒可造成缺血/再灌注損傷。肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning，LIP)即通過(guò)肢體的短時(shí)間缺血預(yù)處理，對(duì)缺血/再灌注損傷的遠(yuǎn)隔臟器如心、腦等產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)作用［2］。本研究建立胎鼠宮內(nèi)窘迫模型，對(duì)孕鼠(母體)行LIP，以胎鼠(子體)海馬線粒體為研究目標(biāo)，通過(guò)對(duì)胎鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能方面觀察，探討母體LIP是否能夠通過(guò)胎盤屏障對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠缺血/再灌注損傷起保護(hù)作用。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年SD大鼠56只，其中雌性42只，雄性14只，體重250～280 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(閩) 2012-0001。按雌雄比例3∶1于前1晚合籠，次日晨8點(diǎn)陰道涂片檢查法確定交配后即可確定為孕1 d，孕20 d時(shí)隨機(jī)抽取40只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組

2.1胎鼠宮內(nèi)窘迫(fetal distress，F(xiàn)D)模型構(gòu)建

取孕20 d大鼠麻醉后下腹正中切開，以無(wú)損傷小動(dòng)脈夾鉗夾近子宮處雙側(cè)子宮動(dòng)靜脈和卵巢動(dòng)靜脈，阻斷子宮胎盤血供致胎鼠宮內(nèi)窘迫，15 min后松開動(dòng)脈夾，將子宮還納入腹腔并縫合。

2.2 LIP模型的構(gòu)建將橡皮筋緊緊地套扎在母鼠右側(cè)腹股溝阻斷右后肢血流(脈搏氧飽和度監(jiān)測(cè))，阻斷/開放各5 min，循環(huán)3次進(jìn)行母體LIP。

2.3實(shí)驗(yàn)分組取40只孕鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組10只。假手術(shù)(sham，S)組僅暴露子宮和卵巢的動(dòng)靜脈但不阻斷; LIP組于母鼠右后肢實(shí)施LIP，其余同S組; FD組阻斷子宮和卵巢的動(dòng)靜脈15 min后松開; LIP+ FD組阻斷通向子宮和卵巢動(dòng)靜脈的同時(shí)行母鼠右后肢LIP。

3主要方法

3.1取材及標(biāo)本處理取材對(duì)象為胎鼠。實(shí)驗(yàn)后24 h剖宮取胎鼠，每只孕鼠隨機(jī)取活胎鼠6只，快速斷頭取腦，并在冰面上剝離海馬。

3.2電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)

海馬CA1區(qū)取1 mm×1 mm×1 mm的組織3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，乙醇-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋;超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，飛利浦208型透射電鏡觀察、攝影。

3.3利用JC-1熒光染色-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法檢測(cè)海馬線粒體膜電位試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，參照試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)JC-1單體時(shí)把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm;檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬組織活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的含量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，參照試劑盒說(shuō)明操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)參數(shù)設(shè)置:激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm。

3.5海馬組織錳-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量的測(cè)定黃嘌呤氧化酶法測(cè)定Mn-SOD活性，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA濃度，定磷法檢測(cè)海馬組織ATP含量變化，3種試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果

S組和LIP組可見(jiàn)核周線粒體豐富，形態(tài)基本正常，膜基本完整，結(jié)構(gòu)清晰可辨，嵴密集，分布有序; FD組線粒體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，嵴變短、嵴間隙增寬，排列紊亂，部分線粒體膜破碎，嵴完全消失，空泡形成; FD+ LIP組可見(jiàn)線粒體輕度腫脹，基質(zhì)電子密度降低，嵴排列尚可，線粒體損傷較FD組明顯減輕，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the fetal hippocampus under transmission electron microscope (×16 000).圖1透射電鏡觀察各組胎鼠海馬CA1區(qū)線粒體的超微結(jié)構(gòu)

2母體LIP對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬線粒體膜電位影響

與S組相比較，F(xiàn)D組和LIP+ FD組線粒體膜電位顯著降低(P＜0.05) ;而與FD組相比較，LIP+ FD組線粒體膜電位降低程度減輕(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of maternal LIP on mitochondrial membrane potential of fetal hippocampal neurons determined by flow cytometry with JC-1 fluorescent probe.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs FD group.圖2母體LIP對(duì)胎鼠海馬線粒體膜電位的影響

3母體LIP對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬ROS、MDA和ATP含量以及Mn-SOD活性的影響

與S組比較，LIP組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性無(wú)明顯變化(P＞0.05) ;與S組比較，F(xiàn)D組和LIP+ FD組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量增加，ATP含量減少，Mn-SOD活性降低(P＜0.05) ;與FD組比較，LIP+ FD組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量明顯降低，ATP含量及Mn-SOD活性顯著增高(P＜0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

討論

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞內(nèi)最為關(guān)鍵的細(xì)胞器之一。為此，尋找有效抑制線粒體結(jié)構(gòu)受損及功能障礙方法成為腦缺血/再灌注損傷治療中最為關(guān)鍵的目標(biāo)。線粒體的正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)的維持需要足夠的ATP，腦缺血過(guò)程，能量供應(yīng)急劇減少，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，同時(shí)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放，Na+、Ca2+和水分進(jìn)入細(xì)胞增多，致線粒體腫脹、嵴斷裂、消失等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞;線粒體界膜可因高度腫脹而破裂，位于線粒體膜間隙的凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)等釋放至胞質(zhì)或轉(zhuǎn)位到胞核，激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)前，線粒體膜電位已經(jīng)開始下降，線粒體膜電位是評(píng)價(jià)線粒體功能的重要指標(biāo)［3］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示母體LIP改善胎鼠腦缺血/再灌注損傷的能量代謝，抑制線粒體膜電位下降，保持胎鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)完整性，提高腦對(duì)缺血缺氧耐受力。

Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the fetal hippocampal tissues.圖3各組胎鼠海馬組織的ROS熒光強(qiáng)度

表1　各組胎鼠海馬組織ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性Table 1.The effects of limb ischemic preconditioning on the levels of ROS，MDA，ATP and Mn-SOD in the fetal hippocampal tissues (Mean±SD.n=10)

缺血/再灌注后導(dǎo)致線粒體損傷的關(guān)鍵是氧化應(yīng)激損傷［4］，主要表現(xiàn)為大量自由基生成，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(如MDA)增加，而機(jī)體抗氧化能力降低。有研究［5］表明LIP可減少再灌注期間自由基的生成，提高機(jī)體的抗氧化能力。腦缺血/再灌注時(shí)，抑制線粒體電子傳遞導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，ROS攻擊生物膜不飽和脂肪酸，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物可引起多種酶類失活、DNA變形，破壞電子傳遞鏈、阻礙氧化磷酸化、增強(qiáng)溶酶體通透性、破壞正常的組織結(jié)構(gòu)。線粒體內(nèi)膜最靠近ROS產(chǎn)生位點(diǎn)，也成為最易被ROS攻擊對(duì)象。然而機(jī)體形成了自身的抗氧化防御體系，其中Mn-SOD是機(jī)體重要氧自由基清除劑，主要存在于線粒體的基質(zhì)中，是線粒體清除氧自由基的第一道防線。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)母體LIP胎鼠海馬組織中的ROS含量、MDA含量降低，Mn-SOD活性提高，提示LIP能夠直接通過(guò)提高線粒體對(duì)ROS的清除力、減少膜的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，對(duì)腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

本課題組前期研究［6］已經(jīng)證實(shí)母體LIP可減輕宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元的凋亡。本研究從海馬線粒體形態(tài)學(xué)及相關(guān)功能方面觀察，表明母體LIP產(chǎn)生的機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)作用可以通過(guò)胎盤屏障對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后起腦保護(hù)作用，為減輕宮內(nèi)窘迫胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/復(fù)氧損傷提供新思路，其機(jī)制可能與抑制線粒體氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。母體LIP產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)因子是通過(guò)何種轉(zhuǎn)導(dǎo)通路透過(guò)胎盤屏障對(duì)胎鼠腦起保護(hù)作用將在后續(xù)研究中深入探討。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Leone TA，F(xiàn)iner NN.Shock: a common consequence of neonatal asphyxia［J］.J Pediatr，2011，158(2 Suppl) : e9-e12.

［2］Hess DC，Hoda MN，Bhatia K.Remote limb preconditioning and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke?［J］.Stroke，2013，44 (4) :1191-1197.

［3］DuchenMR.Roles of mitochondria in health and disease ［J］.Diabetes，2004，53(Suppl 1) : S96-S102.

［4］Guillot M，Charles AL，Chamaraux-Tran TN，et al.Oxidative stress precedes skeletal muscle mitochondrial dysfunction during experimental aortic cross-clamping but is not associated with early lung，heart，brain，liver，or kidney mitochondrial impairment［J］.J Vasc Surg，2014，60 (4) :1043-1051.e5

［5］Pei H，Wu Y，Wei Y，et al.Remote ischemic preconditioning reduces perioperative cardiac and renal events in patients undergoing elective coronary intervention: a metaanalysis of 11 randomized trials［J］.PLoS One，2014，9 (12) : e115500.

［6］吳希珠，鄭曉春，陳小琳，等.母體肢體缺血預(yù)處理對(duì)宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元凋亡的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(4) :729-732，750.

通訊作者△Tel: 0591-88216136; E-mail: zhengxc2@163.com

*［基金項(xiàng)目］福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013J01116) ;福建省衛(wèi)生廳青年研究基金資助項(xiàng)目(No.2013-2-2)

［收稿日期］2015-02-04

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1120-05

［中圖分類號(hào)］R364.4; R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.027