粒毛盤菌DP5胞外多酚的提取及抗氧化活性研究

曹煥英，孫丹宇，楊 柳，錢 瀟，牛兆眾

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

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粒毛盤菌DP5胞外多酚的提取及抗氧化活性研究

曹煥英，孫丹宇，楊 柳*，錢 瀟，牛兆眾

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

[目的]使用樹脂對粒毛盤菌DP5胞外多酚進行提取，并且對其體外抗氧化活性進行評價。[方法]以多酚得率為指標，優(yōu)化粒毛盤菌DP5胞外多酚的提取工藝。[結(jié)果]以大孔樹脂X-5為填充料，進樣濃度為0.64 mg/ml，進樣流速為1 ml/min，洗脫溶劑為濃度80%的乙醇，洗脫流速為1 ml/min，粒毛盤菌胞外多酚含量為815.7 mg GAE/g。體外抗氧化試驗表明，粒毛盤菌DP5胞外多酚具有還原力和清除DPPH自由基、羥自由基(·OH)、亞硝酸鹽(NO2-)的效果，且隨著多酚濃度的升高其活性增強。[結(jié)論]該研究結(jié)果為粒毛盤菌多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

粒毛盤菌;胞外多酚;提取;抗氧化活性

多酚是苯環(huán)上聯(lián)有多個羥基的化合物的總稱。多酚特有的化學結(jié)構(gòu)賦予其良好的抗氧化活性。多酚是植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的皮、根、葉、果。多酚也可由樺褐孔菌、盤龍參內(nèi)生真菌等發(fā)酵獲得。真菌多酚具有較強的自由基清除能力[1-3]。

粒毛盤菌屬(Lachnum)是一類具有重要應(yīng)用價值的真菌，在深層發(fā)酵條件下可以產(chǎn)生多糖、黑色素、多酚等生物活性物質(zhì)[4-6]。目前，關(guān)于粒毛盤菌胞外多酚的純化與活性的研究報道較少。筆者將粒毛盤菌DP5胞外多酚進行純化，并對純化后的多酚進行抗氧化活性的測定，為粒毛盤菌胞外多酚的研究提供一定的科學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌種為粒毛盤菌DP5菌株。子實體采集自中國云南省，由合肥工業(yè)大學微生物資源與應(yīng)用研究室分離、保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 多酚粗提液的制備。取粒毛盤菌發(fā)酵液，醇沉，離心除多糖、蛋白，有機溶劑脫曲酸，離子交換樹脂脫氨基酸，濃縮得多酚粗提液。

取發(fā)酵液，按體積比1∶1加入無水乙醇，4 ℃靜置過夜，進行醇沉脫蛋白、多糖等雜質(zhì)，離心，取上清液進行濃縮，將濃縮液置于冰箱，4 ℃靜置24 h，脫掉部分曲酸，用乙酸乙酯萃取，除掉剩余曲酸，過通用性陽離子交換樹脂脫掉氨基酸和部分還原糖，收集濾液，得多酚粗提液。

1.2.2 多酚的測定(普魯士藍法)。采取Martin L.的方法進行適當修改[7]。取適當稀釋的待測液l ml于25 ml比色管中，加入1 ml 0.1 mol/L 氯化鐵溶液、1 ml 0.008 mol/L鐵氰化鉀溶液，混勻，30 ℃保溫15 min，定容至25 ml，搖勻，用紫外分光光度計在700 nm下測定OD值。以沒食子酸為標準品，測定標準曲線。

1.2.3 柱層析試驗。分別選用不同型號的大孔樹脂和硅膠作為柱層析填充料，進行靜態(tài)吸附與解吸試驗，選擇合適的樹脂或硅膠作為柱層析的填充料。通過動態(tài)吸附與解吸試驗，確認最佳上樣濃度、上樣流速、洗脫溶劑、洗脫流速。

1.2.4 多酚的體外抗氧化活性分析。

1.2.4.1 還原力的測定。參考Lillian等[8]方法，取2.5 ml樣液于試管中，加入2.5 ml 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.6)和2.5 ml濃度1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴20 min，取出后冷卻，再加入濃度10%三氯乙酸2.5 ml，搖勻，終止反應(yīng)。取該溶液5 ml，加入4 ml蒸餾水和1 ml濃度0.1% FeCl3溶液，混勻，靜置15 min，在700 nm處測吸光值。吸光值越大，說明溶液的還原能力越強。

1.2.4.2 多酚提取樣對NO2-的清除效果。取2 ml亞硝酸鈉溶液(5 mg/L)于25 ml比色管中，加入3 ml樣品溶液，混勻，常溫下反應(yīng)30 min，加入0.5 ml濃度0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容至25 ml，搖勻，靜置15 min，在538 nm處測定吸光值。多酚對亞硝酸鹽(NO2-)的清除率公式為：

NO2-清除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0為空白對照的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為樣品溶液加入亞硝酸鈉反應(yīng)后的吸光度。

1.2.4.3 多酚提取樣對羥自由基(·OH)的清除效果。參考Wang等[9]的方法，并略作修改,取2 ml樣液于試管中，加入2 ml 9 mmol/L FeSO4溶液和2 ml 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，充分混勻后，加入2 ml 8.8 mmol/LH2O2溶液，混勻，37 ℃下反應(yīng)30 min，510 nm處測定吸光值?？瞻讓φ战M以相同體積的蒸餾水代替樣品溶液及8.8 mmol/L H2O2溶液。多酚對·OH的消除率公式為：

·OH消除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0為空白對照的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為樣品溶液加入H2O2溶液反應(yīng)后吸光度。

1.2.4.4 多酚提取樣對DPPH自由基的清除效果。取一定濃度的多酚溶液4 ml于試管中，加入1 ml 1 mmol/L無水乙醇配制的DPPH自由基溶液，振蕩混勻后避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光值，計算多酚對DPPH的清除率，以VC為陽性對照。

DPPH清除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0為DPPH和水的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為樣品溶液加入DPPH反應(yīng)后吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱層析試驗

2.1.1 不同樹脂對粒毛盤菌胞外多酚(LEP)吸附與解析的影響。分別選用大孔樹脂D1300、D101、X-5、AB-8、D201、D70和硅膠，進行靜態(tài)吸附與解吸試驗。由表1可知，大孔樹脂X-5的吸附與解吸效果最佳。選擇大孔樹脂X-5作為柱層析的填充料進行后續(xù)研究。

表1 不同大孔樹脂與硅膠樹脂對粒毛盤菌胞外多酚吸附與解析的影響

2.1.2 動態(tài)吸附與解吸試驗。

2.1.2.1 進樣濃度與進樣流速的選擇。進樣濃度設(shè)為0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mg/ml，上樣流速設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0和3.0 ml/min，收集流出液，測定粒毛盤菌胞外多酚含量，計算樹脂的動態(tài)吸附量。

由圖1和圖2可知，以不同濃度多酚溶液進樣，當多酚濃度低于0.64 mg/ml時，隨著多酚濃度的提高，多酚吸附率隨之增大，而當繼續(xù)增加多酚濃度時，多酚吸附率基本達到平衡，吸附率不再增加。因此，選擇進樣濃度為0.64 mg/ml。隨著進樣流速的增大，多酚的吸附率呈下降趨勢，在進樣液流速為0.5 ml/min時多酚的吸附率最高，但是進樣時間較長。經(jīng)綜合考慮，選擇進樣流速為1 ml/min。

2.1.2.2 洗脫劑種類的選擇。洗脫劑分別為乙醚、乙酸乙酯、甲醇以及濃度50%、80%、100%乙醇。由圖3可知，濃度50%乙醇對多酚的解吸效果最佳，但是由于其水含量較高，洗脫的雜質(zhì)也較多。經(jīng)綜合考慮，選擇濃度80%乙醇進行洗脫。

2.1.2.3 洗脫流速的選擇。分別以0.5、1.0、1.5和2.0 ml/min的流速洗脫，以1 BV為1單位收集流出液，測定多酚含量，繪制洗脫曲線。由圖4可知，當洗脫劑的流速較小時，洗脫峰較早出現(xiàn)，且較集中，峰也越高，拖尾現(xiàn)象越不明顯，所以洗脫流速越小，洗脫效果越好。經(jīng)綜合考慮，選擇洗脫速率為1 ml/min。

2.1.3 驗證試驗。將多酚提取液用大孔樹脂X-5進行吸附，進樣濃度為0.64 mg/ml，進樣流速為1 ml/min，洗脫溶劑為濃度80%乙醇，洗脫流速為1 ml/min，收集解吸液，濃縮后冷凍、干燥，得固體。經(jīng)測定，粒毛盤菌胞外多酚的含量由432.7 mg GAE/g提高到815.7 mg GAE/g。

2.2 粒毛盤菌的生物活性試驗 生物活性物質(zhì)的抗氧化性與其還原力有一定的關(guān)系。還原力越強，其抗氧化活性越高[10-11]。由圖5可知，粒毛盤菌DP5胞外多酚的還原力隨著多酚濃度的提高，其還原力增強，與VC的還原力相差不大。粒毛盤菌胞外多酚具有一定的抗氧化能力。

由圖6可知，粒毛盤菌DP5胞外多酚對DPPH自由基的清除效果高于VC，且隨著多酚濃度的升高，其清除率增加。當多酚濃度為0.15 mg GAE/ml，VC濃度為0.15 mg/ml時，多酚對DPPH自由基的清除率是VC的2倍。由此可知，粒毛盤菌DP5胞外多酚具有較強的DPPH自由基清除效果。

NO2-是亞硝胺的前體物質(zhì)。亞硝胺是人體內(nèi)的強致癌物。通過消除體內(nèi)的NO2-，可以降低癌癥發(fā)病率[12]。由圖7可知，粒毛盤菌DP5胞外多酚對NO2-的清除效果明顯，當多酚濃度達到0.2 mg GAE/ml時對NO2-的清除率達到50%。

羥基自由基是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基。它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化損傷，使得細胞壞死或突變[13]。由圖8可知，粒毛盤菌DP5胞外多酚對·OH自由基具有一定的清除效果。

3 結(jié)論

采用柱層析的方法，對粒毛盤菌DP5胞外多酚進行純化。選用X-5大孔樹脂作為柱層析的填充料，并且對其上樣濃度、上樣流速、洗脫溶劑和洗脫流速進行研究，得出最合適的條件，使得粒毛盤菌胞外多酚含量由432.7 mg GAE/g提高到815.7 mg GAE/g，并且對其生物活性進行研究。研究表明，粒毛盤菌DP5胞外多酚對DPPH、NO2-和·OH均有消除效果，且均有還原力。

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ExtractionandAntioxidant Activity of Extracellular Polyphenols fromLachnumDP5

CAO Huan-ying, SUN Dan-yu, YANG Liu*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] The study was to optimize the extraction process of the extracellular polyphenols fromLachnumDP5 (LEP) using resin, and investigate its antioxidant activitiesinvitro.[Method] LEP were extracted and optimal conditions were investigated using single factor experiments. [Result] Macroporous resin X-5 was selected and the extraction conditions were as following: sample concentration of 0.64 mg/ml, the injection flow rate of 1 ml/min, elution solvent of 80% ethanol, the elution flow rate of 1 ml/min. The contend of LEP reached 815.7 mgGAE/g under the optimal conditions. Antioxidant activity analysisin vitro for LEP extraction indicated that the LEP have the ability to scavengingfree radical of DPPH,hydroxyl, NO2-and restoring and the activity was related to its concentrations. [Conclusion]This study was aimed to provide theoretical basis for the development and utilization of LEP.

Lachnum;Extracellular polyphenol; Extraction;Antioxidant activities

合肥工業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2014CX-CYZ041)。

曹煥英(1989-)，女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：真菌活性物質(zhì)。*通訊作者，副教授，博士，從事應(yīng)用微生物方面的研究。

2015-04-20

S 509.9

A

0517-6611(2015)17-012-03