西安交通大學醫(yī)學院附屬西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

杜旭升　魚　軍　李建英　劉　安　楊拴盈△ 　王一理▲

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·論著·基礎研究·

β-欖香烯對肺腺癌A549和H460細胞增殖和凋亡的影響*

西安交通大學醫(yī)學院附屬西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

杜旭升魚軍李建英劉安楊拴盈△王一理▲

目的：探討β-欖香烯對肺腺癌A549和H460細胞增殖和凋亡的影響。方法：應用不同濃度的β-欖香烯干預A549和H460細胞后，臺盼藍拒染試驗和MTT試驗檢測腫瘤細胞的增殖，流式細胞術(shù)檢測A549細胞凋亡率，Western Blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果：不同濃度β-欖香烯能抑制肺腺癌A549和H460細胞的增殖，且呈劑量與時間依賴性，β-欖香烯干預后的A549細胞凋亡率明顯升高，其相關(guān)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達下調(diào)。結(jié)論：β-欖香烯可抑制肺腺癌A549和H460細胞的增殖及誘導其凋亡，其作用機制可能與下調(diào)Bcl-2和Bcl-xl有關(guān)。

近年來隨著手術(shù)方式的改進、化療藥物的研發(fā)及放療技術(shù)的發(fā)展，肺癌患者生存期限有所延長，但仍不能令人們滿意[1]。因此，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物顯得尤為迫切。本實驗擬通過不同濃度β-欖香烯作用于肺腺癌A549和H460細胞，觀察腫瘤細胞的增殖及凋亡率，并探討其可能機制。

材料與方法

1材料與試劑人肺腺癌細胞A549和H460購自ATCC；試劑：10%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、脂質(zhì)體2000購自GIBCO公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；臺盼藍、MTT購自Sigma 公司，BALB/c雄性裸鼠購自西安交通大學實驗動物中心，欖香烯注射液購自大連華立金港藥業(yè)有限公司。

2研究方法

2.1 細胞培養(yǎng)：人肺腺癌細胞A549和H460在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素以及100 g/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞在37℃、含有5% CO2和 95% 空氣的培養(yǎng)箱中孵育。

2.2 臺盼藍拒染試驗檢測細胞活力：具體步驟參見文獻[2]。將細胞按3×105每孔的密度鋪于96孔板中，使用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后進行干預，分為空白對照組及β-欖香烯干預組，空白對照組使用DMSO，β-欖香烯干預組使用不同濃度(0, 100, 200, 300, 400, 500and 600 μM)干預劑進行干預。干預結(jié)束后，細胞在培養(yǎng)箱中分別孵育24、48及72h。胰酶消化細胞后，經(jīng)過PBS懸浮，加入40μl臺盼藍混勻，最后使用細胞計數(shù)器進行計數(shù)，每個濃度具有三個復孔。本實驗至少重復3次。

2.3使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴代四唑試驗(MTT)檢測細胞增殖，具體步驟參見文獻[3]。將細胞按3×105/ml的密度鋪于96孔板中，于培養(yǎng)箱中分別孵育24、48及72h，最后每孔中加入20μl的MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)在37℃環(huán)境下孵育4h。孵育結(jié)束后，棄去上層液體，加入200μl的DMSO，室溫中放置20min。使用波長為570nm的分光光度計檢測每孔的OD值。每個試驗至少重復3次。

2.4流式細胞術(shù)檢測A549細胞凋亡率：V-FITC和PI染色后用流式細胞儀，將細胞鋪于96孔板中后用β-欖香烯進行干預。最終有3×105個細胞用V-FITC/PI染色，被染色的凋亡細胞用流式細胞儀檢測。

2.5 Western Blot法檢測凋亡蛋白：用RIPA裂解液在A549細胞中提取總蛋白，將等量的蛋白質(zhì)加入到12%的SDS-PAGE，之后用電泳的方法對蛋白進行分離。一抗為兔單克隆和多克隆抗體，HRP連接的羊抗兔抗體作為二抗。通過ELC顯色法將結(jié)合的抗體進行顯色。β-actin作為內(nèi)參用于計算其他蛋白質(zhì)的表達水平。所有實驗重復至少3次。

3統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用Dunnett法進行檢驗，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結(jié)　果

1β-欖香烯抑制肺癌細胞的增殖和生存在24、48及72h時間點分別用不同濃度的β-欖香烯對細胞施行干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-欖香烯對A549和H460細胞活力的影響呈現(xiàn)劑量與時間依賴性。β-欖香烯能夠顯著減少存活細胞的數(shù)量，但對A549和H460細胞活力影響無顯著性差異。使用MTT法檢測β-欖香烯對肺癌細胞增殖的影響,β-欖香烯的干預能夠顯著降低A549細胞的增殖。以上結(jié)果提示β-欖香烯能夠抑制肺癌細胞的增殖和生存。鑒于上述實驗結(jié)果，我們將選擇劑量為200μmol的β-欖香烯以及72h這一時間點用于后續(xù)實驗。

2β-欖香烯誘導肺癌細胞凋亡細胞經(jīng)劑量為200μM的β-欖香烯處理，V-FITC/PI染色后，使用流式細胞儀進行檢測。觀察到經(jīng)β-欖香烯處理的A549細胞，凋亡細胞數(shù)量顯著增加。為了解β-欖香烯誘導凋亡的分子機制，我們進一步檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示：β-欖香烯顯著下調(diào)了Bcl-2 和Bcl-xl的表達(P<0.05)，但對Bax 和Bak的表達影響較少(P>0.05)。

討　論

肺癌為癌癥死亡的首要原因，近年來青年和女性人群發(fā)病率及病死率增長迅速，非小細胞肺癌尤其是腺癌所占比重有進一步加大趨勢[4]。雖然針對致癌基因靶向藥物的出現(xiàn)，腺癌生存期有較大改善，但對于基因突變陰性或耐藥的患者仍需要尋求新的方法和藥物。

β-欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取的抗癌有效成分，研究顯示：其可通過抑制腫瘤細胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，從而降低腫瘤細胞有絲分裂能力，抑制腫瘤增殖[5]。本實驗可見給予β-欖香烯干預后A549和H460存活細胞數(shù)目均明顯減少，且呈現(xiàn)劑量與時間依賴性，這與以前研究相符合，但兩者之間無顯著性差異。進一步研究細胞增殖，發(fā)現(xiàn)β-欖香烯的干預對降低A549細胞增殖能力顯著優(yōu)于H460。

研究表明：細胞凋亡參與了腫瘤的形成、發(fā)展及耐藥等環(huán)節(jié)。人體可通過凋亡途徑清除體內(nèi)異常細胞，維持內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定。若凋亡途徑受到破壞、抑制或缺失，異己成分不能被清除，則會引起腫瘤及自身免疫系統(tǒng)疾病。細胞凋亡受多基因嚴格掌控，其中Bcl-2基因家族在其中發(fā)揮著重要的作用,其成員包括以Bcl-2、 Bcl-xl為代表的抗凋亡基因及以Bax、Bak為代表的促凋亡基因，兩者通過二聚體化過程在線粒體水平上調(diào)節(jié)細胞凋亡[6]。本實驗可見經(jīng)β-欖香烯干預后A549細胞凋亡明顯增多，進一步檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2、 Bcl-xl均較對照組明顯減低，雖然Bax、Bak均較對照組有升高趨勢。提示β-欖香烯促進腫瘤細胞凋亡主要是通過下調(diào)Bcl-2、 Bcl-xl完成的。

[1]Li L,Xu L,Qu X,etal. Cbl-regulated Akt and ERK signals are involved in-elemene-induced cell apoptosis in lung cancer cells[J]. Molecular Medicine Reports， 2011，4(6): 1243-1246.

[2] Wang P, Henning SM, Heber D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols[J]. PloS One， 2010,5(4): 10202.

[3] Liu B, Peng XC, Zheng XL,etal. MiR-126 restoration down- regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo[J]. Lung Cancer，2009，66(2):169-175.

[4]劉又寧.呼吸內(nèi)科學高級教程[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012:390-415.

[5] 高紅軍,秦海峰.欖香烯治療非小細胞肺癌的作用機制研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)學生物進展,2010,21(10):4149-4151.

[6]史新惠,王芳.肺癌中相關(guān)凋亡分子的新近研究進展[J].醫(yī)學綜述，2014,20(10):1729-1732.

(收稿：2015-04-20)

Effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 and H460 cells

Xi’an Central Hospital of Medical School,Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710003)

Du XushengYu JunLi Jianyinget al

Objective：To investigate the effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human Lung cancer cells. Methods： Lung cancer A549 and H460 cells were treated with different concentrations of β-Elemene injection,The cell proliferation was measured by trypanblue stain and MTT. A549apoptosis rate was measured by flow cytometry, the expression levels of apoptosis associated protein were explored by western blot. Results： The proliferation of human lung adenocarcinoma A549 and H460 cell line were inhibited significantly by Elemene and the inhibition was time and dose-dependent.The β-Elemene could promote A549 apoptosis,and lower bcl-2 and bcl-xl protein expression．Conclusion：β-Elemene can inhibit the proliferation and apoptosis by lower bcl-2 and bcl-xl protein expression.

Lung neoplasms/physiopathologyApoptosis@β-Elemene

西安交通大學基礎醫(yī)學院腫瘤研究所

R734.2

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.001

* 陜西省自然科學基金項目(2012JC2-06)

△ 西安交通大學第二附屬醫(yī)院

主題詞肺腫瘤/病理生理學細胞凋亡@β-欖香烯