吳雄偉 張丹琴 胡惠瓊 楊金妮 何宗麟 鄭永霞(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江嘉興 314001)

肝干細(xì)胞移植的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景*

吳雄偉 張丹琴 胡惠瓊 楊金妮 何宗麟 鄭永霞△(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江嘉興 314001)

近年來,各類肝臟疾病嚴(yán)重威脅著人的生命安全,而原位肝移植由于存在著供體短缺,免疫排斥,費(fèi)用昂貴等問題,使其廣泛應(yīng)用受到限制。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞具有增殖分化為肝細(xì)胞的潛能。因此,肝干細(xì)胞移植為各類肝病的治療帶來了新的曙光,給患者帶來了新的希望,但仍具有一定的缺陷。本文就肝干細(xì)胞的來源,分類以及肝移植的相關(guān)技術(shù)做一綜述。

肝干細(xì)胞;肝病;移植;治療

1 前言

肝功能衰竭是臨床常見的,死亡率極高的肝病癥候群,我國每年因重癥肝功能衰竭導(dǎo)致死亡的人數(shù)為30-50萬[1]。原位肝移植是治療肝功能衰竭最有效的手段,然而由于供體肝來源缺乏,手術(shù)帶來的損傷,移植排斥以及高費(fèi)用等問題[2-3]限制了這一治療手段的廣泛開展:①供體肝的缺乏是永恒的矛盾:我國是一個(gè)肝病大國,每年肝功能衰竭的患者有50多萬人,而有機(jī)會(huì)接受原位肝移植治療的患者連千分之一都不到[4],供體肝嚴(yán)重缺乏,無法滿足患者的需要。②免疫排斥現(xiàn)象困擾著原位肝移植的應(yīng)用。近年來,肝細(xì)胞移植和生物人工肝等替代療法成為肝功能衰竭治療的突破口,在肝衰竭患者度過危險(xiǎn)期、等待肝源進(jìn)行肝移植以及急慢性肝衰竭的治療中取得了一定的成功[5]。然而,可靠的肝細(xì)胞來源仍是肝細(xì)胞移植和生物人工肝研究領(lǐng)域共同的難點(diǎn)。

肝干細(xì)胞是成人體內(nèi)存在的擁有自我增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞,在應(yīng)激刺激下,肝干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和其他組織細(xì)胞。因此,肝干細(xì)胞以其低免疫原性和高增殖分化潛能的特性[6],不僅為肝細(xì)胞移植和生物人工肝提供了充足和安全的終末分化的肝細(xì)胞,還有效減少了免疫排斥反應(yīng),從而為肝病的治療帶來了新的希望。

2 肝干細(xì)胞的來源

在1958年,Wilson等通過實(shí)驗(yàn)研究證明肝臟中存在干細(xì)胞,并以此推測(cè)卵圓細(xì)胞和小型肝細(xì)胞可能是肝干細(xì)胞的前體細(xì)胞,但是并非所有人都支持這個(gè)觀點(diǎn),其中就有人認(rèn)為卵圓細(xì)胞并不是肝干細(xì)胞的前體細(xì)胞而僅僅只是活化形式的肝干細(xì)胞[7]。一般而言,肝干細(xì)胞在絕大多數(shù)情況下都是處于靜止?fàn)顟B(tài)的,這對(duì)于去確定其標(biāo)記蛋白的工作產(chǎn)生了極大的阻礙,同時(shí)其活化的分子機(jī)制比較復(fù)雜,至今未有人能完全掌握。但是隨著科技的進(jìn)步與醫(yī)學(xué)界的高度重視和對(duì)肝干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí),以及細(xì)胞分離技術(shù)的逐漸成熟和骨髓移植技術(shù)等的逐步應(yīng)用[8],現(xiàn)在對(duì)于鑒別肝干細(xì)胞及其前體細(xì)胞的技術(shù)和方法已有了很大的進(jìn)步。

目前,干細(xì)胞起源于膽小管樹的小膽管和赫令管(Canals of hering,COH)的觀點(diǎn)[9]得到了絕大多數(shù)人的贊同。赫令管是毛細(xì)膽管和小葉間膽管之間的細(xì)小單管,處于門靜脈周圍肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞相結(jié)合的部位,這符合肝卵圓細(xì)胞既可分化為肝細(xì)胞又可分化為膽管上皮細(xì)胞的雙向分化潛能,并且在這里干細(xì)胞才可自我更新和分化為祖細(xì)胞,所以它也被形象的稱為肝干細(xì)胞的壁翕(Niche)[10]。此外,部分學(xué)者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了肝干細(xì)胞也可以從其它組織的細(xì)胞分化而來[10]。因此肝干細(xì)胞的來源并不是單一的,而是多源性的,甚至還有跨胚層分化現(xiàn)象的存在[11]。

3 肝干細(xì)胞的類型及功能

肝干細(xì)胞的來源并不是單一的,一般來說它可以分為兩大類,一是肝源性肝干細(xì)胞包括卵圓細(xì)胞、小肝細(xì)胞和成熟的肝細(xì)胞等;二是非肝源性肝干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、胰腺上皮細(xì)胞和骨髓造血干細(xì)胞等。

3.1 肝源性干細(xì)胞

3.1.1 肝卵圓細(xì)胞(Hepatic oval cell)

細(xì)胞小但其核大,狀似卵圓形,胞漿量少嗜堿性并且淺染。當(dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷或肝功能嚴(yán)重紊亂時(shí),低分化的卵圓細(xì)胞就從靜止?fàn)顟B(tài)被激活,并通過不斷地增殖、分化形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞替換掉受損的肝細(xì)胞,從而達(dá)到肝臟再生的目標(biāo)[12]?，F(xiàn)在大部分學(xué)者都傾向于支持肝卵圓細(xì)胞是肝始祖細(xì)胞的觀點(diǎn)但是也有學(xué)者認(rèn)為,肝卵圓細(xì)胞來自于骨髓,因?yàn)槁褕A細(xì)胞與骨髓干細(xì)胞都有表達(dá)Thy-1,Flt-3R,c-Kit、CD34等的相同表面標(biāo)記物,并且肝和骨髓都具有造血功能。

3.1.2 小肝細(xì)胞(Small hepatocyte-like progenitor cell)

單核細(xì)胞,細(xì)胞核較小,體積小僅是成熟肝細(xì)胞1/3-1/2,它的增殖方式是呈鋪路石樣,通常情況下,是在肝臟嚴(yán)重受損時(shí)才出現(xiàn)。有研究表明在胚胎發(fā)育晚期小肝細(xì)胞是先于肝細(xì)胞形成的,而肝細(xì)胞是經(jīng)過其在其它相關(guān)因素作用下進(jìn)一步分化成熟的[13],因此可推斷出肝卵圓細(xì)胞并不能直接分化成肝細(xì)胞,需要小肝細(xì)胞來進(jìn)行過渡,即小肝細(xì)胞可能是肝細(xì)胞的專能祖細(xì)胞。

3.1.3 成熟肝細(xì)胞

成熟的肝細(xì)胞屬于完全分化細(xì)胞,是一種終末細(xì)胞不再具備增殖和分化能力,這是以往被普遍認(rèn)可的,但近年來的研究結(jié)果推翻了這一觀點(diǎn),成熟肝細(xì)胞不僅可以自我復(fù)制70次以上,而且還具有歸巢能力[14]即成熟的肝細(xì)胞擁有一定的可塑性和增殖及分化的潛能。

3.2 非肝源性干細(xì)胞

3.2.1 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell)

有一個(gè)或幾個(gè)核仁,核漿比例大,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,是一種高度未分化的全能干細(xì)胞,具有能分化出人體所有組織細(xì)胞的潛能。在體外培養(yǎng)時(shí),它仍然具有無限增殖、自我更新和多向分化的特性,同時(shí)可被定向誘導(dǎo)分化為所需要的組織細(xì)胞。Shiraki等[15]研究表明胚胎干細(xì)胞在不同的培養(yǎng)條件下都可分化為肝細(xì)胞即培養(yǎng)條件對(duì)其的影響并不大。擬胚體法(EB)是目前最常采用胚胎干細(xì)胞分化的方法,其最大的特點(diǎn)是具有空間三維結(jié)構(gòu),與胚胎發(fā)育過程相仿[16]。

3.2.2 骨髓干細(xì)胞

目前經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)來源于骨髓或者胎肝的間充質(zhì)干細(xì)胞都具有向肝細(xì)胞分化的潛能[17-19]。Aurich等[18]將人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng),通過在培養(yǎng)基內(nèi)添加相關(guān)的生長(zhǎng)因子將其誘導(dǎo)分化為肝實(shí)質(zhì)樣的細(xì)胞。然后將其移植入免疫缺陷的Pfp/Rag2大鼠,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞在遷移至肝小葉門靜脈區(qū)域后,仍可繼續(xù)表達(dá)糖原、PCK1、間隙連接蛋白CX32、白蛋白和人類肝細(xì)胞特異抗原Hep-Parl這種現(xiàn)象表明該細(xì)胞在肝臟整合后仍保留著肝細(xì)胞的主要功能,并沒有因此而失去作用。另外,由于肝干細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)內(nèi)胚層和間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,因此在該基礎(chǔ)之上就有人提出了可能存在一種間充質(zhì)-內(nèi)胚層祖細(xì)胞的觀點(diǎn)[20]。魯學(xué)恒等人的實(shí)驗(yàn)[21]結(jié)果表明肝臟病理環(huán)境對(duì)移植細(xì)胞的定植有促進(jìn)作用,使其具有較高的分化率;同時(shí)也提示了在正常的肝臟中,移植的骨髓干細(xì)胞能定植,但難以存留太長(zhǎng)時(shí)間,因?yàn)殡S著時(shí)間的推移它有愈漸減少的趨勢(shì),同時(shí)它的作用機(jī)制也尚未明確。

3.2.3 胰腺上皮細(xì)胞

可被定向誘導(dǎo)分化形成肝細(xì)胞,并且能夠表達(dá)肝細(xì)胞特異蛋白[22]但對(duì)培養(yǎng)條件的要求非?？量獭?/p>

4 肝細(xì)胞移植技術(shù)的相關(guān)操作

4.1 肝細(xì)胞移植相關(guān)技術(shù)

肝細(xì)胞的移植包括肝細(xì)胞的分離、保存和擴(kuò)增。肝細(xì)胞的分離技術(shù)包括機(jī)械分離法、酶解法,EDTA以及TPB螯合法[23]。隨著研究的不斷深入,五步酶解法以及灌注法的出現(xiàn)減少了肝細(xì)胞分離的損傷。彭齊榮等人提出了一項(xiàng)半原位分離的技術(shù),這種技術(shù)的流程較短,操作簡(jiǎn)單,膠原酶使用劑量少,并且不需特別的設(shè)備,而且細(xì)胞成活率高。關(guān)于肝細(xì)胞的保存,肝細(xì)胞低溫凍存技術(shù)使得肝細(xì)胞能保持較長(zhǎng)時(shí)間的活性。有研究表明,低溫凍存的肝細(xì)胞再經(jīng)過凍融后,其新陳代謝與增殖能力不僅還存在,而且其臨床實(shí)驗(yàn)治療效果更好。因此,可利用體外培養(yǎng)獲得的大量肝細(xì)胞建立細(xì)胞庫,便于肝細(xì)胞的移植。然而,目前大量培養(yǎng)肝細(xì)胞并確保其活性費(fèi)用高昂,臨床應(yīng)用有限。

4.2 肝細(xì)胞移植的部位和方式

肝移植的方式大致可分為原位肝移植和異位肝移植兩種方式。肝移植的部位主要是通過門靜脈在肝內(nèi)、腹腔、脾等地方植入肝細(xì)胞。肝臟本身的微環(huán)境及門靜脈血液豐富的營養(yǎng)成分,在理論上均有利于肝細(xì)胞移植,所以它們也是細(xì)胞移植的理想場(chǎng)所[23]。另外,微囊化、微載體技術(shù)和生物膜的發(fā)展進(jìn)一步促進(jìn)了腹腔中肝細(xì)胞的定植。在腹腔中移植肝細(xì)胞,雖然其操作比較簡(jiǎn)單,但是在肝細(xì)胞移植以后,受體非常容易發(fā)生過敏情況,并且在3天之內(nèi)可被清除。脾內(nèi)的移植效果較為理想,且最佳的HCT部位也是脾臟,雖然將肝細(xì)胞植入身體中的其他部位也可起到支持代謝的效果。將脾內(nèi)的肝細(xì)胞植入,在使肝細(xì)胞的形態(tài)及功能得到保持的同時(shí)也使得其存活和增殖的時(shí)間得以延長(zhǎng)。還有一些人通過在肝動(dòng)脈中插管,從而將肝細(xì)胞移植所需要的置管置入,這解決了肝細(xì)胞懸液進(jìn)行體外持續(xù)注射的問題。

5 肝干細(xì)胞培養(yǎng)及移植中存在的問題

5.1 肝干細(xì)胞培養(yǎng)存在的問題

目前,肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)的獲得率低,因此研究肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法以提高其體外培養(yǎng)的獲得率是肝干細(xì)胞研究重要方向。Rambhatla等[24]通過丁酸鈉誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝干細(xì)胞分化,獲得了75%至80%的白蛋白陽性細(xì)胞。另外,有學(xué)者根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的分選和細(xì)胞功能的分選由混雜細(xì)胞中篩選出純化的肝干細(xì)胞,但此類技術(shù)消耗費(fèi)用巨大,性價(jià)比低并不適合廣泛推廣。

5.2 肝干細(xì)胞移植存在的問題

目前,肝移植有兩種基本方式,一是構(gòu)建功能性的器官如生物人工肝代替宿主原有受損的肝臟來維持肝功能的正常;二是將細(xì)胞直接移植到宿主體內(nèi),通過移植細(xì)胞的不斷增殖分化替換掉受損的肝細(xì)胞來達(dá)到恢復(fù)肝功能的目的。肝臟無疑是肝干細(xì)胞首選的移植部位,首先對(duì)于移植的肝干細(xì)胞來說它是一個(gè)非常良好的生長(zhǎng)環(huán)境,其次它分泌的細(xì)胞因子又對(duì)肝干細(xì)胞發(fā)育,成熟有促進(jìn)作用,使其能在肝中盡早的發(fā)揮功能。

盡管肝干細(xì)胞的移植為重癥肝病患者的治療帶來了曙光,但要將其真正運(yùn)用到臨床治療中則還有許多問題值得去更深入地探討和研究:①移植時(shí)機(jī)的問題。雖然肝干細(xì)胞可通過卵圓細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞等具有增殖和分化潛能的細(xì)胞誘導(dǎo)分化來獲得,但是目前還無法確定培養(yǎng)過程中的哪一階段移植才能達(dá)到最好治療效果。例如在細(xì)胞分化早期移植,移植的細(xì)胞尚無肝干細(xì)胞的功能及標(biāo)志,就無法達(dá)到治療的目的;在細(xì)胞分化晚期移植,它的增殖能力就受到了極大的限制,并不能大量及無限的增殖,難以達(dá)到改善肝臟功能的目的。②移植數(shù)量的問題。目前到底移植多少數(shù)目的肝干細(xì)胞才是最合適的仍然是個(gè)謎。如果肝干細(xì)胞移植數(shù)量不能滿足它的需求,則其在肝內(nèi)無法充分發(fā)揮其作用;反之,則又面臨著血管阻塞等危險(xiǎn)。③細(xì)胞移植后的監(jiān)測(cè)手段。對(duì)于肝干細(xì)胞移植后在體內(nèi)分化、增殖、生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)和功能狀態(tài)等方面都缺乏一種有效的監(jiān)測(cè)方法。目前,最常用的定位追蹤方法是使用示蹤劑,而其大多數(shù)為熒光物質(zhì)。在國外,有研究者曾嘗試在雌性動(dòng)物身上通過Y染色體來示蹤,但這種方法操作繁雜且無法動(dòng)態(tài)地觀察移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的連續(xù)性變化,并不適合推廣及未來臨床的應(yīng)用。然而活體示蹤劑的出現(xiàn)則彌補(bǔ)了這一缺陷,但其也存在著不足即它的標(biāo)記效率低,因此必須找到一種良好示蹤劑來解決該問題,提高其標(biāo)記效率。④肝干細(xì)胞是肝癌細(xì)胞潛在來源。肝癌的來源有許多假說,其中就有肝癌源于干細(xì)胞的假說,而且許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持此假說,即干細(xì)胞在肝內(nèi)可分化為成熟的肝細(xì)胞也有可能分化為肝癌細(xì)胞。

6 肝干細(xì)胞的應(yīng)用前景

肝干細(xì)胞作為一種新興的種子細(xì)胞來源,它在治療各種肝病中均擁有非常廣闊的應(yīng)用前景及非常珍貴的價(jià)值,它既能代替受損嚴(yán)重的肝細(xì)胞并將其除去,又以此刺激機(jī)體組織再生從而修復(fù)自身肝臟,恢復(fù)其功能,而且它具有低免疫原性,可有效降低或消除排斥反應(yīng)發(fā)生的概率。肝干細(xì)胞可以為肝衰竭患者度過危險(xiǎn)期或等待肝源移植提供一個(gè)緩沖期和對(duì)受損肝臟進(jìn)行修復(fù),延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間,提高其存活率?？偠灾?肝干細(xì)胞移植為終末期肝病的治療提供了一個(gè)新的突破點(diǎn),相信隨著研究的進(jìn)一步深入,肝干細(xì)胞移植將成為可能,并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域充分發(fā)揮其作用。

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Research progress and application prospects of liver stem cell transplantation*

Wu Xiong-wei,Zhang Dan-qin,Hu Hui-qiong,Yang Jing-ni,He Zong-lin,Zheng Yong-xia△
(Medical School,Jiaxing College,Zhejiang Jiaxing 314001)

2015-7-20)

浙江省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào):Y201330031);嘉興學(xué)院大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):SRT2014B117);嘉興學(xué)院大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):SRT2014B129)

吳雄偉,男,嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生,Email:675799083@qq.com。

△通訊作者:鄭永霞,女,講師,主要從事肝再生機(jī)制的研究,Email:zhengyongxia@163.com。