周寧，吳洪陽，黃本榮，楊娜娜，韓肖華

重復經(jīng)顱磁刺激對腦缺血大鼠海馬突觸素表達及學習記憶的影響

周寧1a，吳洪陽2，黃本榮1b，楊娜娜1a，韓肖華1a

目的：觀察10Hz重復經(jīng)顱磁刺激（rTMS）對腦缺血大鼠海馬突觸素（SYN）的表達及學習記憶的影響。方法：將36只雄性SD大鼠隨機分成假手術組、模型組和rTMS組，每組12只。制備雙側頸總動脈永久結扎腦缺血模型，假手術組不造成缺血，rTMS組給予10Hz rTMS，共28次。采用Morris水迷宮評價學習記憶能力；利用電生理實驗檢測海馬CA1區(qū)的長時程增強（LTP）；Western blot檢測海馬SYN蛋白的含量。結果：與假手術組比較，模型組的逃避潛伏期明顯延長，60 s內跨越平臺次數(shù)減少；與模型組比較，rTMS組大鼠的逃避潛伏期縮短，60 s內跨越平臺次數(shù)增加，fEPSP波幅提高，海馬SYN蛋白的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05）。結論：rTMS能促進腦缺血大鼠海馬SYN蛋白的表達和增強高頻刺激引起的LTP，這可能是rTMS改善腦缺血損傷引起的學習記憶障礙的作用機制之一。

經(jīng)顱磁刺激；腦缺血；突觸素；長時程增強；學習記憶

自1985年Barker等首次將磁刺激技術應用到中樞神經(jīng)系統(tǒng)以來，經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation，TMS)以其無創(chuàng)、無痛、操作簡便、可深部刺激及副作用小等優(yōu)勢被廣泛應用于基礎和臨床。1989年出現(xiàn)的重復經(jīng)顱磁刺激 (repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)，可以利用一定強度的時變磁場來刺激興奮組織,在皮質產生可傳導性的感生電流，從而對刺激位點或皮質興奮性產生抑制或易化，影響大腦的電活動和調節(jié)大腦皮質的興奮性。近年來，因在刺激結束后仍有持續(xù)的生物學效應，rTMS逐漸被作為一種治療手段應用于抑郁癥[1]、帕金森病[2]、卒中[3]等疾病。

新近的一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，rTMS可促進卒中患者手運動功能的恢復和大腦皮質的可塑性[3]，有動物實驗也證實rTMS可改善急性腦梗死大鼠的運動感覺功能[4]，但rTMS對腦缺血后學習記憶功能的影響及其可能的機制尚不十分清楚。突觸傳遞的長時程增強（long-term potentiation，LTP）是指高頻刺激（high-frequency stimulation，HFS）傳入神經(jīng)纖維后引起突觸效能的持續(xù)性增強,是研究學習記憶的重要電生理指標之一。突觸素（synaptophysin，SYN）是突觸囊泡的一種特異標志性膜蛋白，與神經(jīng)可塑性密切相關。本研究擬觀察rTMS對腦缺血大鼠海馬SYN蛋白和LTP的影響，以期從結構和功能角度闡釋rTMS改善腦缺血大鼠學習記憶功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠36只，體質量（250±20）g，由同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組和rTMS組，每組12只。

1.1.2 實驗試劑 抗大鼠SYN抗體（購于美國Chem icon公司），β-Tubulin（購于美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照Annaházi等[5]的方法復制大鼠雙側頸總動脈永久性結扎（2-vesselocclusion，2VO）腦缺血模型。腹腔注射6%的水合氯醛（350mg/kg），頸部正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，避免損傷迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)干，以“4”號絲線雙重結扎；假手術組只分離雙側頸總神經(jīng)，不結扎。

1.2.2 干預方法 采用武漢依瑞德公司生產的磁刺激儀（CCY-I型），動物環(huán)形線圈（線圈外徑6 cm，中心最大磁場強度3.5 T）中心處于大鼠前囟右旁開0.5 cm處（M 1區(qū)），刺激強度為120%靜息運動閾值（26%最大磁場強度），刺激頻率為10 Hz，總刺激量為300脈沖，單序列30脈沖，中間間隔50 s。rTMS組大鼠于造模成功次日即開始治療，每日1次，共28次。模型組和假手術組自然飼養(yǎng)，不作特殊處理。

1.2.3 Morris水迷宮測試 定位航行實驗：從實驗的第24天開始每天訓練4次，共訓練5 d，記錄其尋找到平臺的時間（逃避潛伏期），反映動物的學習能力。如果大鼠在60 s內未找到平臺，潛伏期記為60 s，并由實驗者將其牽引至平臺上，停留30 s，再放回籠中?？臻g探索實驗：實驗第29天進行空間探索實驗，撤除平臺，任意選一個入水點將大鼠放入水中，記錄其在60 s內跨越平臺次數(shù)，反映大鼠的空間記憶能力。

1.2.4 Western blot檢測SYN蛋白 治療結束時，每組隨機選擇6只大鼠，腹腔注射6%的水合氯醛深度麻醉，迅速斷頭取腦，剝離大腦皮質，稱取右側海馬組織50mg，裂解、勻漿，取上清液，蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉移和膜封閉，封閉結束后分別用抗大鼠SYN抗體室溫孵育。二抗孵育后顯色、曝光、顯影，以Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分析SYN蛋白條帶灰度值，計算各條帶灰度值與內參β-Tubulin蛋白條帶灰度值的比值，進行半定量分析。

1.2.5 LTP測定 治療結束時，各組選取余下大鼠，烏拉坦麻醉（1.4 g/kg i.p）后固定于腦立體定位儀上。記錄電極定位坐標：前囟后（AP）為3.0～3.3mm，中縫線右旁開（R）為2.0～2.5mm，硬腦膜下的深度（H）為1.8～2.2mm；刺激Schaffer側枝電極坐標：AP為3.6～3.8 mm，R為3.2～3.5mm，H為2.0～2.5mm。用推進器在坐標處將刺激和記錄電極尖端插入到相應的深度，用單脈沖刺激即可記到興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）。HFS參數(shù)設定：電壓強度為最大響應值75%～85%所對應的電壓幅度值，刺激模式-串單刺激，波寬0.2ms，延時40 ms，波間隔9.8ms，重復次數(shù)4次，脈沖組數(shù)100，主周期300 s。用多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄和分析CA1區(qū)細胞外場電位。測出fEPSP幅度(mV)，以HFS 30m in前的fEPSP的幅度均值作為基礎水平，再分別計算出HFS后60 min內各觀測時刻fEPSP平均幅度(mV)與HFS前基礎水平幅度(mV)平均值的百分比。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試結果

模型組大鼠在定位航行實驗中的逃避潛伏期與假手術組比較明顯延長< 0.05）；在空間探索實驗中，60 s內跨越平臺次數(shù)與假手術組比較減少（<0.05），提示模型組大鼠存在學習記憶功能障礙。與模型組比較，rTMS組大鼠的逃避潛伏期縮短，60 s內跨越平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05），提示經(jīng)過rTMS治療后，腦缺血大鼠的學習記憶功能改善（表1）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試結果比較（±s）

注：與假手術組比較，①<0.05；與模型組比較，②<0.05

分組 只數(shù) 逃避潛伏期/s 60s內跨越平臺次數(shù)/次假手術組 12 13.38±5.84 4.03±0.76模型組 12 37.15±7.43① 1.83±0.51①rTMS組 12 24.38±6.77①② 3.48±0.89②

2.2 LTP測定結果

HFS后于各組大鼠患側海馬CA1區(qū)記錄到的fEPSP的波幅均較HFS前有所增加，尤其以假手術組明顯，達到刺激前基礎水平幅度的（148.35±24.42）%；模型組增至基礎水平的（116.78±21.94）%；rTMS組的fEPSP波幅顯著提高，達到刺激前基礎水平幅度的（132.33±19.58）%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（< 0.05）（圖1、表2）。

2.3 SYN蛋白印跡分析結果

表2 各組大鼠SYN蛋白表達及fEPSP幅度比較（±s）

注：與假手術組比較，①<0.05；與模型組比較，②<0.05

分組 n SYN蛋白 fEPSP幅度/%假手術組 6 0.23±0.07 148.35±24.42模型組 6 0.47±0.10① 116.78±21.94①rTMS組 6 0.63±0.16①② 132.33±19.58②

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，中國缺血性腦卒中發(fā)病率占總卒中的45.5%～75.9%[6]。缺血性腦卒中影響患者的認知功能，可嚴重影響患者的康復治療效果及其日常生活質量，最終可能發(fā)展為血管性認知障礙。因此對于腦缺血患者，除了關注其運動功能的恢復外，如何提高其學習記憶功能也至關重要。海馬與認知功能密切相關，海馬損傷可導致學習與記憶功能障礙[7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是缺血缺氧損傷最敏感的效應靶器官之一，海馬神經(jīng)元對缺血缺氧非常敏感。缺血性腦卒中患者常出現(xiàn)注意力不集中、學習記憶能力下降等表現(xiàn)，實驗動物也表現(xiàn)Morris水迷宮實驗成績下降[8,9]。因此，本研究觀察rTMS對腦缺血大鼠海馬突觸素及學習記憶的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬SYN蛋白的表達較假手術組增高，反映機體在缺血缺氧時，SYN表達和生成增加[10]，這可能與腦缺血導致?lián)p傷區(qū)微環(huán)境變化，刺激神經(jīng)再生有關。但中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力較低下。SYN是突觸囊泡的一種特異標志性膜蛋白，其數(shù)量和分布密度可間接反映突觸的密度[11]，突觸功能重建時SYN表達明顯增多，與神經(jīng)可塑性密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，rTMS能促進腦缺血大鼠海馬SYN蛋白的表達，這為rTMS治療促進缺血性卒中患者海馬突觸功能重建提供了佐證。

本研究在Morris水迷宮實驗中觀察到rTMS能明顯縮短缺血大鼠逃避潛伏期，增加其60 s內跨越平臺次數(shù)，提示rTMS能改善腦缺血大鼠的學習記憶障礙，與趙文娟等[12]和趙秀秀等[13]的研究結論相近。海馬是學習記憶過程中起關鍵作用的中樞結構，LTP是海馬突觸可塑性的重要形式，是學習記憶的神經(jīng)細胞學基礎[14]。本研究同時在電生理實驗中發(fā)現(xiàn)rTMS對腦缺血大鼠海馬HFS誘導的LTP有增強作用，這與行為學實驗結果一致，即從整體和細胞水平證實rTMS對腦缺血損傷引起的學習記憶障礙有改善作用。

由于在皮質產生可傳導性的感生電流，從而影響大腦的電活動和調節(jié)大腦皮質的興奮性，因此rTMS越來越廣泛地運用于神經(jīng)科學和康復醫(yī)學領域[15]。本研究證實，rTMS能促進腦缺血大鼠海馬SYN蛋白的表達和增強對海馬HFS誘導的LTP，這可能是rTMS改善腦缺血損傷引起的學習記憶障礙的作用機制之一，為rTMS運用于缺血性卒中導致的學習記憶障礙的臨床治療提供了實驗依據(jù)。

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（本文編輯：王晶）

Objective:To investigate the effect of rTMS on the expression of synaptophysin in hippocampus and learning and memory in rats after cerebral ischemia.Methods:Thirty six male Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham operation group,model group and rTMS group.A rat model of permanent bilateral occlusion of the common carotid arteries(2-vessel occlusion,2VO)was established.rTMS treatments(10 Hz)were performed once per day since 1 d after 2VO,lasting for 28 d.The function of learning and memory of rats was assessed by Morris water maze test.The changes of long-term potentiation in CA1 area were investigated with electrophysiology study and the expression of synaptophysin in hippocampus was investigated with Western blot technique.Results:Compared with the sham operation group,the rats of model group demonstrated significantly increased latency to locate the submerged platform and decreased frequency of swimming across the platform in 60 s.In the rTMs group,the latency to find the submerged platform decreased,the frequency of swimming across the platform in 60 s increased,the amplitude of field excitatory postsynaptic potentials increased and the expression of synaptophysin in hippocampus increased significantly,compared with those of model group（<0.05）.Conclusion:rTMS could promote the expression of synaptophysin in hippocampus and increase the LTP induced by high frequency stimulation,which may be one of the possible mechanisms of amelioration learning and memory impairment after cerebral ischemia.

transcranial magnetic stimulation;cerebral ischemia;synaptophysin;long-term potentiation;learning and memory

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.002

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 a.康復醫(yī)學科，b.泌尿外科武漢430030

2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院針灸科武漢430022

湖北省自然科學基金（No.2012FFB024 32）；國家自然科學基金（No.81171858）

2014-06-06

韓肖華hanxiao1470@sina.com