李劍，王建禎

(1濟(jì)源市人民醫(yī)院，河南濟(jì)源 459000；2北京武警總醫(yī)院)

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腦膠質(zhì)瘤組織中MRP、MGMT蛋白、P-gp的表達(dá)觀察

李劍1，王建禎2

(1濟(jì)源市人民醫(yī)院，河南濟(jì)源 459000；2北京武警總醫(yī)院)

摘要：目的觀察腦膠質(zhì)瘤組織中多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、六氧甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)蛋白、P糖蛋白(P-gp)的表達(dá)情況。方法腦膠質(zhì)瘤組織64例份(觀察組)，正常腦組織12例份(對(duì)照組)，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)兩組腦組織中的MRP、MGMT蛋白和P-gp。結(jié)果觀察組MRP、MGMT蛋白、P-gp陽(yáng)性率分別為78.1%、67.2%、42.2%，對(duì)照組分別為8.3%、8.3%、0，兩組比較，P均<0.05。觀察組不同性別、不同年齡(<40歲，≥40歲)MRP、MGMT蛋白、P-gp陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組中MRP與MGMT蛋白、MGMT蛋白與P-gp、P-gp與MRP表達(dá)無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤組織中MRP、MGMT蛋白和P-gp高表達(dá)。

關(guān)鍵詞：腦腫瘤；膠質(zhì)瘤；多藥耐藥相關(guān)蛋白；嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶；P糖蛋白

腦膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率最高，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了膠質(zhì)瘤的手術(shù)療效。術(shù)后化療在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療中起積極作用，但腦膠質(zhì)瘤對(duì)大多數(shù)化療藥物不敏感。近年來(lái)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)某些耐藥基因及其產(chǎn)物的表達(dá)是出現(xiàn)耐藥的重要機(jī)制。與其相關(guān)的基因有多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)基因、六氧甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)、多藥耐藥基因等，它們的表達(dá)產(chǎn)物MRP、MGMT蛋白、P糖蛋白(P-gp)可分別通過(guò)各自不同的分子生物學(xué)機(jī)制導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)不同的化療藥物產(chǎn)生耐藥[1～4]。本研究采用免疫組化法檢測(cè)了64例人腦膠質(zhì)瘤中的MRP、MGMT蛋白、P-gp，旨在為人腦膠質(zhì)瘤的化療提供新的思路與方法。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源選擇2010年3月～2011年8月北京武警總醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織64例份(觀察組)，所有患者均為初發(fā)病例并經(jīng)病理明確診斷，其中男40例、女24例，年齡20～72歲。依據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2000)分類，Ⅲ級(jí)42例、Ⅳ級(jí)22例。另選擇正常腦組織12例份(對(duì)照組)，為同期顱腦外傷術(shù)中切除的腦組織和同期因腦動(dòng)靜脈畸形而行手術(shù)治療患者為顯露病灶而切除的正常腦組織，這些腦組織均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。

1．2主要試劑MRP小鼠抗人單克隆抗體、MGMT小鼠抗人單克隆抗體、P-gp小鼠抗人單克隆抗體、SP-9002免疫組化試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自北京山生物技術(shù)公司；PBS緩沖液、4%中性甲醛溶液由北京武警總醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室配制;70%、90%、95%、100%乙醇,二甲苯購(gòu)自北京化工廠。

1．3MRP、MGMT蛋白、P-gp檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法。將兩組腦組織石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，按照常規(guī)SP法檢測(cè)MRP、MGMT蛋白和P-gp。結(jié)果判定：腦組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為MGMT蛋白陽(yáng)性；細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)有棕黃色顆粒為MRP、P-gp陽(yáng)性。在高倍鏡(200×)下對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，10%～30%為+，≥30%為++，+、++視為陽(yáng)性。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

觀察組MRP、MGMT蛋白、P-gp陽(yáng)性率分別為78.1%、67.2%、42.2%，對(duì)照組分別為8.3%、8.3%、0，兩組比較，P均<0.05。觀察組中不同性別(男、女)MRP陽(yáng)性率分別為80.0%、75.0%，MGMT蛋白陽(yáng)性率分別為70.0%、62.5%，P-gp陽(yáng)性率分別為45.0%、37.5%；不同年齡(<40歲、≥40歲)MRP陽(yáng)性率分別為71.4%、81.4%，MGMT蛋白陽(yáng)性率分別為61.9%、69.8%，P-gp陽(yáng)性率分別為33.3%、46.5%；不同性別、年齡各蛋白陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組中MRP與MGMT蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.0696，P=0.5849)，MGMT蛋白與P-gp表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.0905，P=0.4768)，P-gp與MRP蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.0708，P=0.5784)。

3討論

化療為人腦膠質(zhì)瘤綜合治療體系中的重要治療手段之一，然而臨床化療的效果并不理想，膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物的耐藥性是影響化療效果的主要因素。腦膠質(zhì)瘤化療耐藥是由多種因素共同作用引起的，其可能存在的因素有：血腦屏障的存在導(dǎo)致藥物難以到達(dá)腫瘤細(xì)胞；藥物在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的積聚減少；DNA損傷的修復(fù)；化療藥物的解毒代謝加快等。近年來(lái)，許多學(xué)者試圖從分子水平闡明人腦膠質(zhì)瘤化療耐藥發(fā)生的機(jī)制。

MRP既是一種能量泵，同時(shí)也是一種谷胱甘肽偶合泵，可介導(dǎo)化療藥物中的葡萄糖醛酸甙共軛物、谷胱甘肽硫共軛物和硫酸鹽共軛物排出細(xì)胞，從而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。MRP不但定位于細(xì)胞膜，而且還存在于高爾基濾泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等處，可參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡的運(yùn)輸，引起藥物亞細(xì)胞分布的改變，在細(xì)胞內(nèi)隔離化療藥物，使化療藥物不能與其靶位點(diǎn)結(jié)合，從而間接導(dǎo)致耐藥[5,6]。本研究結(jié)果表明，MRP在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較正常腦組織高，且與性別、年齡無(wú)關(guān)。MRP主要對(duì)天然植物類抗腫瘤藥、烷化劑、鉑類耐藥。MGMT是一種相對(duì)分子質(zhì)量為22 kDa的普遍存在的DNA修復(fù)酶，可保護(hù)染色體免受烷化劑的損傷。MGMT在星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的含量最高，在小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含量極低，在各類顱內(nèi)腫瘤中的含量也不相同。MGMT可通過(guò)修復(fù)被亞硝脲類化療藥物烷基化的鳥(niǎo)嘌呤從而阻止DNA交鏈的形成，降低此類化療藥物的細(xì)胞毒作用[7]，因此，MGMT基因及其產(chǎn)物的表達(dá)與亞硝脲類化療藥物的耐藥密切相關(guān)[8,9]，提示MGMT表達(dá)陽(yáng)性的腦膠質(zhì)瘤患者不宜用替莫唑胺(TMZ)等亞硝脲類化療藥物治療。孫彥輝等[10]報(bào)道，MGMT陰性表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者的生存期明顯高于陽(yáng)性表達(dá)的患者，所以MGMT還可以作為判斷人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，MGMT蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較正常腦組織高，且與性別、年齡無(wú)關(guān)。P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥是研究最廣泛、最深入的耐藥途徑。P-gp是一種能量依賴性藥物輸出泵，它既具有與一些抗腫瘤藥物結(jié)合的部位，又具有ATP結(jié)合位點(diǎn)，故P-gp一旦與某些抗腫瘤藥物結(jié)合，就能通過(guò)ATP提供能量，將抗腫瘤藥物泵出腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。P-gp高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后常不良，可作為判斷預(yù)后的粗略指標(biāo)。方勝等[11]用免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)63例腦膠質(zhì)瘤組織中P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率為39.68%，化療后較化療前的陽(yáng)性率明顯升高。本研究結(jié)果顯示，人腦膠質(zhì)瘤中P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率為42.2%，高于正常腦組織。許多學(xué)者的研究均證實(shí)，P-gp的陽(yáng)性表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物的敏感性呈明顯的負(fù)相關(guān)。P-gp主要導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒類化療藥物、抗生素類化療藥物及激素類化療藥物耐藥。

總之，腦膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，MRP、MGMT蛋白、P-gp在人腦膠質(zhì)瘤組織均有較高表達(dá)，他們分別通過(guò)不同的耐藥機(jī)制導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，故聯(lián)合檢測(cè)它們?cè)谌四X膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況可指導(dǎo)臨床醫(yī)生為每位腦膠質(zhì)瘤患者制定合理的個(gè)體化化療方案。

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收稿日期：(2015-05-14)

中圖分類號(hào)：R739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2015)47-0062-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.024