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基因芯片檢測(cè)技術(shù)與基因測(cè)序技術(shù)在遺傳性耳聾產(chǎn)前診斷中的聯(lián)合應(yīng)用

方媛，王傳霞，索峰，劉向紅

耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷之一[1]。60%的先天性耳聾伴有一定程度的遺傳性因素[2]。利用常規(guī)聽(tīng)力物理篩查手段并不能夠解決日益增多的遲發(fā)性、漸進(jìn)性和藥物敏感性耳聾的診斷及干預(yù)治療[3]。基因檢測(cè)技術(shù)能夠準(zhǔn)確定位致病基因突變位點(diǎn)，了解疾病形成機(jī)理，有針對(duì)性也干預(yù)治療和預(yù)防疾病發(fā)生。對(duì)于中國(guó)人群耳聾致病基因特異性研究[4]表明，GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、12s rRNA是主要的耳聾致病基因。本研究在遺傳性耳聾產(chǎn)前診斷中聯(lián)合應(yīng)用基因芯片檢測(cè)技術(shù)與基因測(cè)序技術(shù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

臨床資料：選擇2013年10月～2015年10月就診于徐州市婦幼保健院的2 156例孕婦，年齡18～40歲。本研究經(jīng)孕婦本人和家屬知情同意。

基因芯片檢測(cè)技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用方法：采集所有孕婦血液進(jìn)行遺傳性耳聾微陣列芯片的篩查。采用博奧生物公司的晶芯@九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括微陣列芯片及相關(guān)檢測(cè)和提取試劑。微陣列基因芯片包含4個(gè)中國(guó)人群常見(jiàn)的遺傳性耳聾致聾基因的9個(gè)突變熱點(diǎn)，分別是GJB2基因35delG、176、235delC、299的4個(gè)位點(diǎn)，GJB3基因538C>T的1個(gè)位點(diǎn)，SLC26A4(PDS)基因2168A>G、IVS-7-2A>G的2個(gè)位點(diǎn)，12s rRNA基因1494C>T、1555A>G的2個(gè)位點(diǎn)。芯片規(guī)格(76.20±0.50)mm×(25.40±0.25)mm×(1.00±0.10)mm，掃描區(qū)域22 mm×72 mm，檢測(cè)靈敏度≤0.1個(gè)熒光分子/μm2。對(duì)于GJB2和SLC26A4(PDS)基因突變的陽(yáng)性病例，進(jìn)一步針對(duì)其丈夫進(jìn)行遺傳性耳聾基因測(cè)序檢測(cè)驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證首先通過(guò)合成9個(gè)突變熱點(diǎn)位置的針對(duì)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)Sanger測(cè)序法，利用一代測(cè)序儀3130X1基因分析儀進(jìn)行測(cè)序及分析。針對(duì)孕婦及其丈夫都是同一基因型的病例，通過(guò)羊水穿刺術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行確診診斷。

結(jié)果：2 156例孕婦中遺傳性耳聾陽(yáng)性病例96例(4.45%)。其中陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)例數(shù)最多的是GJB2基因，其陽(yáng)性突變例數(shù)58例(突變位點(diǎn)位于35delG、176、235delC、299分別為1、3、46、8例)。SLC26A4(PDS)基因陽(yáng)性突變例數(shù)28例(突變位點(diǎn)位于2168A>G、IVS-7-2A>G分別為6、22例)。GJB3基因538C>T位點(diǎn)陽(yáng)性突變5例。12s rRNA基因陽(yáng)性突變5例，突變位點(diǎn)均位于1555A>G。共發(fā)現(xiàn)7對(duì)夫妻攜帶同一基因的陽(yáng)性突變，其中GJB2基因共發(fā)現(xiàn)5對(duì)(突變位點(diǎn)均位于235delC，)，SLC26A4(PDS)基因共發(fā)現(xiàn)2對(duì)突變位點(diǎn)均位于IVS-7-2A>G。最終羊水穿刺確診2例GJB2基因純合突變胎兒，3例GJB2基因雜合突變，2例SLC26A4(PDS)基因雜合突變。

討論：遺傳性耳聾是一種相對(duì)比較復(fù)雜的遺傳性疾病，到目前為止，鑒定報(bào)道的與遺傳性耳聾有關(guān)的基因已有80多個(gè)，有67個(gè)常染色顯性/隱性遺傳基因，3個(gè)X連鎖耳聾基因和7個(gè)線粒體耳聾基因[5]，而致聾基因的致聾熱點(diǎn)突變非常密集。本研究根據(jù)最新的流行病學(xué)分析及臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，選取了4個(gè)最為常見(jiàn)的先天性致聾基因共計(jì)9個(gè)突變熱點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模篩查，其陽(yáng)性檢出率達(dá)4.45%，能夠較好地反映人群致聾基因的攜帶和分布情況[6]。選取的4個(gè)基因是基于常年大規(guī)模的中國(guó)人群遺傳性耳聾研究的結(jié)果基礎(chǔ)，具有廣譜性，適合進(jìn)行篩查。對(duì)攜帶藥物敏感性耳聾基因(12s rRNA)的孕婦及胎兒進(jìn)行用藥指導(dǎo)，終身禁用氨基糖苷類藥物，可在三級(jí)預(yù)防階段避免耳聾發(fā)生。本研究表明，GJB2和SLC26A4(PDS)基因突變率較高，分別為60.42%和29.17%，需要篩查機(jī)構(gòu)引起重視?？梢?jiàn)，芯片檢測(cè)結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)對(duì)于指導(dǎo)遺傳性耳聾的產(chǎn)前篩查和診斷具有非常重要的作用。本研究過(guò)程中，由于微陣列基因芯片的篩查特性和經(jīng)濟(jì)學(xué)效益限制，檢測(cè)的基因種類和突變位點(diǎn)相對(duì)偏少，需在以后的篩查過(guò)程中，逐漸下降經(jīng)濟(jì)成本,逐步增加高危、高頻的基因種類并加入更多的突變位點(diǎn)，這對(duì)精確篩查有非常重要的指導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cohen M, Phillips JA 3rd. Genetic approach to evaluation of hearing loss[J]. Otolaryngol Clin North Am, 2012,45(1):25-39.

[2] Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics[J]. Mutat Res, 2009,681(2-3):189-196.

[3] Zhang J, Wang P, Han B, et al. Newborn hearing concurrent genetic screening for hearing impairment-a clinical practice in 58,397 neonates in Tianjin, China[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2013,77(12):1929-1935.

[4] 張東紅,邱海濤,馬秀嵐,等.新生兒聾病基因GJB2, SLC26A4, 線粒體12S rRNA的分子流行病學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,39(8):649-651.

[5] H?kli S, Luotonen M, Sorri M, et al. Audiological follow-up of children with the m.1555A>G mutation in mitochondrial DNA[J]. Audiol Neurootol, 2013,18(1):23-30.

[6] 劉學(xué)忠,歐陽(yáng)小梅,袁慧軍,等.中國(guó)人群遺傳性耳聾研究進(jìn)展[J].中華耳科學(xué)雜志,2006,4(2):81-89.

收稿日期：(2015-09-06)

通信作者：顧茂勝

基金項(xiàng)目：徐州市醫(yī)學(xué)青年后備人才資金資助(2014011)。

doi：(徐州市婦幼保健院，江蘇徐州 221009)10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.042