李旻昊，張國志，袁梅，李曙光，陳俊卯(河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院，河北唐山063000;無錫市第五人民醫(yī)院)

慢傳輸型便秘大鼠胃腸組織中PI3K/AKT/eNOS信號通路相關標志物的表達變化及意義

李旻昊1，張國志1，袁梅2，李曙光1，陳俊卯1
(1河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院，河北唐山063000;2無錫市第五人民醫(yī)院)

摘要:目的觀察慢傳輸型便秘(STC)大鼠胃腸組織PI3K/AKT/eNOS信號通路相關標志物(p-Akt蛋白、NO 及eNOS)的表達變化，并探討其意義。方法84只健康成年Wistar大鼠，隨機分為對照1組、對照2組、模型1組、模型2組、模型3組及模型4組，各14只。模型1、2、3、4組每日予以苯乙哌啶(8 mg/kg)灌胃制作STC模型，對照1、2組予以等量生理鹽水灌胃。模型3組及模型4組大鼠飼養(yǎng)第70天時，每天腹腔分別注射10 mg/mL的LY294002(100 mg/kg)和50 mg/mL的L-NAME(10 mg/kg)。對照1組60 d時、對照2組90 d時、模型1組60 d時、模型2組90 d時、模型3組90 d時及模型4組90 d時，采用Western blotting法檢測各組大鼠胃竇、小腸和遠端結腸組織p-Akt蛋白。對照1組60 d時、對照2組90 d時、模型1組60 d時、模型2組90 d時采用ELISA試劑盒法檢測胃腸組織中NO和eNOS含量。結果模型1組遠端結腸組織p-Akt蛋白表達較對照1組低，模型2組小腸、遠端結腸組織p-Akt蛋白表達較對照2組低，模型3組遠端結腸組織p-Akt蛋白表達較模型2組低，模型4組遠端結腸組織p-Akt蛋白表達較模型2組高(P均＜0.05)。模型1組、模型2組大鼠胃竇、小腸、遠端結腸組織NO和eNOS含量呈逐漸增高趨勢(P均＜0.05)。結論STC大鼠胃竇組織p-Akt表達變化不明顯，小腸組織p-Akt表達有減少趨勢，遠端結腸組織p-Akt表達明顯降低，胃竇、小腸、遠端結腸組織NO和eNOS含量增多且呈逐漸增高趨勢。推測PI3K/AKT/eNOS信號通路參與了大鼠STC的發(fā)生，而且主要是通過影響遠端結腸組織來完成。

關鍵詞:慢傳輸型便秘;實驗動物模型; p-Akt蛋白;一氧化氮;內皮型一氧化氮合酶

慢傳輸型便秘(STC)是一種以腸動力障礙為特征的臨床疾病，主要表現(xiàn)為大便次數減少、便意缺乏、大便干燥、排出困難等癥狀。STC 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，該類患者常伴有腹脹，聽診腸鳴音明顯減少，嚴重影響患者的生活質量。目前對STC病因及發(fā)病的具體信號機制尚缺乏足夠的認識。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)家族是生長因子超家族信號轉導

［3］郭新賓，崔維韻，劉慶國，等.人外周血內皮祖細胞分離培養(yǎng)與鑒定［J］.中國現(xiàn)代神經疾病雜志，2009，9(12) : 159-163.

［4］霍清萍，孔林，李金菩，等.300例缺血性腦血管病患者中醫(yī)證候的多元統(tǒng)計研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2008，6 (12) : 1407-1410.

［5］趙輝，王鍵.試論多因素復合制作病證結合動物模型思路［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2001，20(5) : 57-58.

［6］周小航，王喜軍.關于中醫(yī)證候動物模型的思考與展望［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31(4) : 78-80.

［7］趙慧輝，王偉.病癥結合證候模型研究基本思路［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(12) : 762-764.

［8］扈新剛，張允嶺，柳洪勝，等.氣虛血瘀大鼠模型表征及血液流變學研究［J］.天津中醫(yī)藥，2007，24(2) : 138-141.

［9］金洪鍵，楊世海.人參花提取物對氣虛血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響［J］.人參研究，2013，11(1) : 11-12.

［10］朱黎霞，張英豐.不同配比黃芪丹參對氣虛血瘀證模型大鼠血液流變學及TXB2、6-keto-PGF1α影響的研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2014，11(22) : 14-15.

［11］楊海燕，朱盼龍，王新志.消栓膠囊對氣虛血瘀型缺血性中風的療效和血流變學、血管內皮功能的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(17) : 342-346.

［12］胡湘蜀，周東，羅祖明.內皮祖細胞對局灶性腦缺血大鼠血管內皮修復作用的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代神經疾病雜志，2009，9 (2) : 164-167.

［13］Chu K，Jung KH，Lee ST，et al.Circulating endothelial progenitor cells as a new marker of endothelial dysfunction or repair in acute stroke［J］.Stroke，2008，39(5) : 1441-1447.

［14］Fadini GP，Coracina A，Baesso I，et al.Peripheral blood KDR+endothelial progenitor cells are determinants of subclinical atherosclerosis in amiddle-aged general population［J］.Stroke，2006，37(9) : 2277-2282.

［15］Moubarik C，Guillet B，Youssef B，et al.Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke ［J］.Stem Cell Rev，2011，7(1) : 208-220.

過程中的重要分子，可被多種細胞因子和理化因素激活。蛋白激酶Akt是位于PI3K下游的調節(jié)分子。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路參與了細胞生長、增殖、分化、運動、存活和代謝等相關的信號轉導［1］。NO作為一個重要的信使分子，與機體的炎癥反應、氧化應激及細胞增殖等密切相關［2］。本研究觀察了STC大鼠胃腸組織PI3K/AKT/eNOS信號通路相關標志物(p-Akt蛋白、NO及eNOS)的表達變化，并探討其意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器苯乙哌啶(河南省常樂制藥廠)，p-Akt抗體(美國Cell Signaling公司) ; PI3K阻斷劑LY294002和eNOS抑制劑L-NAME(美國Sigma公司)，NO及eNOS試劑盒(上海銳聰實驗室設備有限公司)，BL-410生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，銀絲電極(自制，直經0.5 mm，長4 mm)。

1.2STC動物模型建立及胃腸組織獲取84只健康成年Wistar大鼠，220～240 g，雌雄各半，由河北聯(lián)合大學動物實驗中心提供。隨機分為對照1組、對照2組、模型1組、模型2組、模型3組及模型4組，各14只。模型1、2、3、4組每日予以苯乙哌啶(8 mg/kg)灌胃制作STC模型，對照1、2組予以等量生理鹽水灌胃。模型3組及模型4組大鼠飼養(yǎng)第70天時，每天腹腔分別注射10 mg/mL的LY294002 (100 mg/kg)和50 mg/mL的L-NAME(10 mg/kg)。每5 d記錄1次大鼠大便粒數、大便干重，采用活性炭灌胃法測定首粒黑便排出時間來評估腸道傳輸功能。60 d時，模型1、2、3、4組日均糞便粒數小于對照1、2組，日均每粒糞便質量大于對照1、2組，首粒黑便排出時間長于對照1、2組(P均＜0.05) ;且與對照1組相比，模型1組大鼠結腸慢波頻率明顯減慢，振幅增加，波形表現(xiàn)為不規(guī)則的近似正弦波樣曲線。STC大鼠造模成功。對照1組60 d時、對照2 組90 d時、模型1組60 d時、模型2組90 d時、模型3組90 d時及模型4組90 d時采用戊巴比妥溶液0.22 g/100 g行腹腔內注射麻醉、固定。經上腹正中切口入腹，暴露腹腔，冷PBS沖洗，用眼科剪剪取胃竇、小腸和遠端結腸組織，備測。

1.3p-Akt蛋白、NO及eNOS檢測p-Akt蛋白檢測采用Western blotting法。將各組大鼠的胃腸組織液氮研磨，轉入離心管，加入冷PBS 2～3 mL，高速勻漿30 s，1 000 r/min離心2 min，重復2～3次，棄上清，沉淀中加入蛋白裂解液100～200 μL(用前加入PMSF，兩者比例為100∶1，30 min內有效)，依組織量而定，冰上裂解10～20 min，4℃，15 000 r/min，離心15 min，取上清，分裝至1 mL EP管中－70℃保存。采用BCA蛋白定量法，將各組蛋白分裝標記完成，煮沸后保存于超低溫冰箱中或進行電泳實驗。電泳后的膠體經過轉膜、封閉等步驟，孵上一抗，放在冰箱中的搖床上4℃過夜，8～12 h后取出，PBS沖洗3次，孵上二抗，常溫下?lián)u1～2 h后，暗室進行顯色，得到顯有所需條帶的X線片，將定影后的X線片用Mixrotek Scan Wizard掃描軟件進行電腦掃描，Image J圖像分析軟件做灰度分析。對照1 組60 d時、對照2組90 d時、模型1組60 d時、模型2組90 d時采用ELISA試劑盒法檢測胃腸組織中NO和eNOS含量。

1.4統(tǒng)計學方法采用SigmaStat3.5統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

各組大鼠胃竇、小腸和遠端結腸組織p-Akt蛋白、NO、eNOS水平比較見表1。對照1組、對照2組大鼠胃竇、小腸及遠端結腸組織NO和eNOS含量差異變化不明顯;模型1組、模型2組大鼠胃竇、小腸、遠端結腸組織NO和eNOS含量呈逐漸增高的趨勢(P均＜0.05)。

表1　各組大鼠胃竇、小腸和遠端結腸組織p-Akt蛋白、NO、eNOS水平比較(±s)

注:與對照1組比較，*P＜0.05;與對照2組比較，#P＜0.05;與模型2組遠端結腸組織比較，△P＜0.05。

組別　p-Akt蛋白　NO(μmol/g)　eNOS(U/mg)對照1組胃竇　35 520.90±457.82　105.75±2.47　4.08±1.80小腸　34 247.74±387.15　107.36±2.33　4.11±2.05遠端結腸　36 420.90±367.83　107.43±2.38　4.07±1.96對照2組胃竇　36 148.30±398.34　108.35±1.96　4.09±1.74小腸　36 071.50±265.71　106.80±2.92　4.10±1.97遠端結腸　34 665.80±368.32　105.16±2.45　4.09±1.63模型1組胃竇　35 542.33±398.76　144.85±2.29　4.96±2.89小腸　33 701.41±412.49　168.57±2.61　5.33±3.36遠端結腸　28 142.33±413.29*212.74±2.56　5.90±3.32模型2組胃竇　35 534.69±479.41　140.09±2.54　4.76±2.57小腸　26 529.70±369.46#161.24±2.17　5.27±2.94遠端結腸　26 534.69±383.46#204.47±2.83　5.65±3.07模型3組遠端結腸　18 246.71±871.48△　?。。Ｐ?組遠端結腸　33 218.71±531.70△?。。?/p>

3　討論

STC嚴重影響患者的生活質量［3］，目前臨床治療效果仍不理想［4，5］。因此找到其病因及發(fā)病具體機制，從根本上找到合理的治療方案至關重要。本研究采用臨床上常用的止瀉劑復方苯乙哌啶經進行灌胃建立大鼠STC模型，該模型大鼠排便次數減少，腸道傳輸減慢，與便秘患者具有相同的臨床癥狀和病理生理改變。

NO作為腸道神經系統(tǒng)中主要的抑制性神經遞質，參與腸道動力調節(jié)、腸黏膜血流調節(jié)、分泌功能調節(jié)等，可作為抑制劑直接松弛腸道平滑肌，并可通過減弱腸道慢波起博使結腸環(huán)肌自發(fā)性鐘擺式節(jié)律收縮減少，其在便秘發(fā)病機制中的作用受到了廣泛關注［6～8］。NO是由L-精氨酸經NOS催化合成。NOS是NO合成的限速酶，其中eNOS是合成NO的主要限速酶。因NO很不穩(wěn)定，而且在體內需通過NOS的作用才能生成，因此更多研究傾向于NOS。Shahid等［9］研究發(fā)現(xiàn)，黏膜下叢和肌間叢NOS免疫反應性均明顯增高，從而證實NOS在STC發(fā)病中的作用，其機制可能是黏膜下叢和肌間叢內大量的NOS神經元釋放NO，使結腸推進性收縮受到抑制。譚麗等［10］研究顯示，NOS在STC組的表達增強，陽性細胞數目增多，NOS的異常表達誘導過量的NO生成，過多的NO會使結腸處于持續(xù)抑制狀態(tài)，從而導致腸道蠕動減弱，參與了STC的發(fā)病過程。Sjolund等［11］對NO在STC患者結腸中的作用進行了研究，衡量在應用不同的自主神經阻斷劑前后，離體肌條對電場刺激的反應，認為由NO所介導的非腎上腺非膽堿能抑制性神經的增加為引起STC患者的結腸動力紊亂的重要機制。但是關于其發(fā)生的具體信號機制仍然不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，STC大鼠胃竇組織p-Akt表達變化不明顯，小腸組織p-Akt表達有減少趨勢，遠端結腸組織p-Akt表達明顯降低，胃竇、小腸、遠端結腸組織NO和eNOS含量增多且呈逐漸增高趨勢。且在運用PI3K阻斷劑LY294002 和NOS抑制劑L-NAME后，遠端組織p-Akt的表達升高，所以我們推測PI3K/AKT/eNOS信號通路參與了大鼠STC的發(fā)生，而且主要是通過影響遠端結腸組織來完成。

研究［12］發(fā)現(xiàn)，Cajal間質細胞在控制胃腸道運動中起重要作用，主要參與胃腸道慢波電活動，傳導電活動，傳遞神經沖動。STC患者結腸中Cajal間質細胞密度顯著減少，且細胞體積也縮?。?3～16］。但是PI3K/AKT/eNOS信號通路是否是通過作用于Cajal間質細胞，從而影響結腸的慢波活動，導致STC的發(fā)生，還需進一步研究。

參考文獻:

［1］Ma P，Gu B，Xiong W，et al.Glimepiride promotes osteogenic differentiation in rat osteoblasts via the PI3K/Akt/eNOS pathway in a highglucose microenvironment［J］.PLoS One，2014，9 (11 ) : e112243.

［2］Yu J，Yao H，Gao X，et al.The role of nitric oxide and oxidative stress in intestinal damage induced by selenium deficiency in chickens［J］.Biol Trace Elem Res，2015，163(1-2) : 144-153.

［3］Wald A，Sigurdsson L.Quality of life in children and adults with constipation［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25(1) : 19-27.

［4］Zhang LL，Zhang J，Wang YZ.Study on colonic motility and efficacy analysis in patients with slow-transit constipation treated with self-formulated Xingchang Decoction［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29(5) : 403-406.

［5］丁曙晴，丁義江，張?zhí)K閩，等.白術水煎液治療結腸慢傳輸性便秘36例療效觀察［J］.新中醫(yī)，2005，37(9) : 30-31.

［6］Hansen MB.The enteric nervous systemⅡ: gastrointestinal functions［J］.Pharmacol Toxicol，2003，92(6) : 249-257.

［7］Shah V，Lyford G，Gores G，et al.Nitric oxide in gastrointestinal health and disease［J］.Gastroenterology，2004，126(3) : 903-913.

［8］Tomita R，Igarashi S，F(xiàn)ujisaki S，et al.The effects of neurotensin in the colon of patients with slow transit constipation［J］.Hepatogastroenterology，2007，54(78) : 1662-1666.

［9］Shahid S，Ramzan Z，Maurer AH，et al.Chronic idiopathic constipation: more than a simple colonic transit disorder［J］.J Clin Gastroenterol，2012，46(2) : 150-154.

［10］譚麗，譚至柔，黃雪，等.不同類型一氧化氮合酶在慢傳輸型便秘大鼠結腸中的表達［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2011，20 (1) : 64-66.

［11］Sjolund K，F(xiàn)asth S，Ekman R，et al.Neuropeptides in idiopathic chronic constipation (slow transit constipation)［J］.Neurogastroenterol Motil，1997，9(3) : 143-150.

［12］Hanani M，F(xiàn)reund HR.Interstitial cells of Cajal--their role in pacing and signal transmission in the digestive system［J］.Acta Physiol Scand，2000，170(3) : 177-190.

［13］Wedel T，Spiegler J，Soellner S，et al.Enteric nerves and interstitial cells of Cajal are altered in patients with slow-transit constipation and megacolon［J］.Gastroenterology，2002，123(5) : 1459-1467.

［14］Lee JI，Park H，Kamm MA，et al.Decreased density of interstitial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slow-transitconstipation and acquired megacolon［J］.J Gastroenterol Hepatol，2005，20(8) : 1292-1298.

［15］He CL，Burgart L，Wang L，et al.Decreased interstitial cell of cajal volume in patients with slow-transit constipation［J］.Gastroenterology，2000，118(1) : 14-21.

［16］Lyford GL，He CL，Soffer E，et al.Pan-colonic decrease in interstitial cells of Cajal in patients with slow transit constipation［J］.Gut，2002，51(4) : 496-501.

·臨床研究·

(收稿日期:2015-02-03) 2014-10-29)

通信作者:張國志

文章編號:1002-266X(2015) 19-0027-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R574

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.009