王靜，韓麗，遲曉云，馮智慧(青島思達(dá)中獅國(guó)際心肺血管醫(yī)院，山東青島6607;青島市中心血站)

1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學(xué)鑒定

王靜1，韓麗2，遲曉云2，馮智慧2
(1青島思達(dá)中獅國(guó)際心肺血管醫(yī)院，山東青島266071;2青島市中心血站)

摘要:目的對(duì)1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，確定其ABO血型的等位基因型。方法1例ABO血型正反定型不符患者，對(duì)其血液樣本進(jìn)行血型血清學(xué)檢測(cè)、ABO基因分型檢測(cè)、ABO基因Exon6、7序列分析。結(jié)果該樣本血清學(xué)結(jié)果正反定型結(jié)果不符，正定型抗A弱凝集，反定型檢出不規(guī)則抗-A，血清學(xué)符合A亞型的表現(xiàn)。ABO基因分型檢測(cè)的結(jié)果顯示為O1/A。Exon6、7外顯子及第6內(nèi)含子序列單倍型測(cè)序與A101相比，其中一個(gè)等位基因?yàn)镺102(261G/del、297A＞G、646T＞A、681G＞A、771C＞T、829G＞A) ;另外一個(gè)等位基因?yàn)锳205(467C＞T、1009A＞G)，導(dǎo)致P156L、R337G。結(jié)論本例ABO血型基因Exon7的兩個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致了A氨基轉(zhuǎn)移酶的活性降低，為A205亞型。

關(guān)鍵詞:血型; A亞型;基因突變;基因測(cè)序

人類血型系統(tǒng)有35種，但ABO血型系統(tǒng)仍是最具臨床意義的血型系統(tǒng)。目前，ABO變異型(亞型)的等位基因報(bào)道較多［1，2］。在ABO基因庫(kù)中，ABO亞型基因已超過300余種，其中A亞型超過140種，中國(guó)人群的A亞型也陸續(xù)有報(bào)道［3，4］。本研究對(duì)1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，確定其ABO血型的等位基因型。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料患者女，26歲，因胸悶就診于青島市某心肺血管醫(yī)院，醫(yī)院檢測(cè)ABO血型正反定型不符，2014年10月29日將患者一份血液樣本(EDTANa2抗凝)送至青島市中心血站中心血型參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。該患者無輸血史，無懷孕流產(chǎn)史，未患重大疾病或接受過手術(shù)，近期無感染史。

1.2試劑及主要儀器單克隆抗-A、單克隆抗-B、抗-AB、抗A1(Sanquin公司) ;試劑ABO紅細(xì)胞、抗-H、A2細(xì)胞(上海生物制品有限公司) ;人源抗-A、抗-B(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所) ;抗-D試劑(Millipore公司) ;基因組DNA提取試劑盒(Invitrogen公司) ; ABO基因分型初篩試劑盒(ReadyGene公司) ; Ex-Taq試劑盒、LA-Taq試劑盒(TaKaRa公司)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3血型血清學(xué)檢測(cè)患者全血標(biāo)本離心取50 μL壓積紅細(xì)胞三洗，試管法正反定型。懷疑A亞型后加做人源-A、人源-B、-A1、A2c和-H，應(yīng)用篩選細(xì)胞和一組試劑譜細(xì)胞進(jìn)行抗體篩選和抗體鑒定，明確或排除不規(guī)則抗體的存在。

1.4ABO基因分型檢測(cè)提取標(biāo)本基因組DNA，采用Invitrogen DNA提取試劑盒提取。DNA定量分析檢測(cè)DNA濃度，純度A260/A280比率在1.6～1.9。按照ReadyGene ABO血型基因檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝胺電泳，以150 V電泳12 min凝膠紫外成像，并且分析ABO血型SSP基因分型結(jié)果。

1.5ABO基因Exon6、7序列分析引物設(shè)計(jì)參照Olsson等［5］的報(bào)道，對(duì)Exon6和Exon7進(jìn)行雙向擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下: 95℃預(yù)變性10 min; 94℃、60 s，63℃、90 s，72℃、60 s，10個(gè)循環(huán); 94℃、60 s，61℃、90 s，72℃、60 s，25個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min，10℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化，正反雙向測(cè)序。在ABI3100-Avant上進(jìn)行測(cè)序分析。對(duì)其PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，克隆入T載體后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑選6～10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，確定樣本的單倍型。序列分析采用Gentle軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1血清學(xué)結(jié)果紅細(xì)胞檢測(cè)出弱A抗原，血清中存在弱抗A抗體，血清學(xué)表現(xiàn)為Ax型，不規(guī)則抗體檢測(cè)陰性。正定型中標(biāo)本-A+，人源-A++，與-A1、-B、人源-B無反應(yīng)。反定型中A1c+，Bc+++，與A2c、Oc、自身c無反應(yīng)?？?H中Pc++++，Ac++，Oc++++。紅細(xì)胞A抗原較弱，且不與-A1抗體反應(yīng)，H抗原表現(xiàn)較強(qiáng)，與O型紅細(xì)胞H抗原相當(dāng);血清反定型中有弱的-A1抗體(+)。

2.2基因分型結(jié)果標(biāo)本基因初步分型結(jié)果為O1/A，見圖1。

2.3ABO基因Exon6、7序列分析結(jié)果經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，Exon6雜合位點(diǎn)為261G/del、297A/G。Exon7 為467C/T、646A/T、681A/G、771C/T、829A/G、1009A/G。見圖2。經(jīng)過克隆測(cè)序，與參比序列A101比較確定標(biāo)本的基因型為A205/O102(表1)。

3　討論

目前已發(fā)現(xiàn)約341種ABO等位基因。ABO亞型的形成具有不同的分子機(jī)制，主要為堿基缺失、插入、替代、拼接點(diǎn)突變、等位基因雜交等。A型主要的兩種亞型為A1和A2，兩種亞型占A型的99.9%。A2是A亞型比較常見的一種亞型，約占A型的20%，其血清學(xué)的特點(diǎn)表現(xiàn)為正定-A與試劑單克隆-A反應(yīng)呈弱凝集，與人源多克隆-A反應(yīng)稍強(qiáng)，與試劑單克隆-A1不反應(yīng);反定血清中可檢出抗A1抗體，與A2c不反應(yīng);在血型反定型的檢測(cè)中1%～8%的A2個(gè)體和25%的A2B個(gè)體血清中產(chǎn)生同種抗A1抗體。有學(xué)者使用單克隆抗體的流式細(xì)胞檢測(cè)，估計(jì)了A1與A2紅細(xì)胞上抗原位點(diǎn)的數(shù)量分別是8×105～12×105與1×105～4×105。目前國(guó)際上報(bào)道的A2等位基因有A201～A221，共22種。A205等位基因是日本學(xué)者Ogasawara等首次報(bào)道，國(guó)內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)多種A2亞型［6，7］，且中國(guó)人群中A2亞型的分子結(jié)構(gòu)以A205占優(yōu)勢(shì)［8］，大多數(shù)A2等位基因先證者為亞洲人群［9，10］。上海血液中心數(shù)據(jù)顯示中國(guó)人群中A201等位基因占A2亞型的20%［11］。有報(bào)道高加索人群中幾乎所有A2亞型的遺傳基因?yàn)锳201。我們發(fā)現(xiàn)的A205亞型與Gen-Bank公布的基因序列一致，標(biāo)本基因含467C＞T、1009A＞G兩個(gè)突變。堿基的替換使得部分氨基酸也發(fā)生了變化，導(dǎo)致位156氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榱涟彼?Leu)，337位氨基酸由精氨酸(Arg)轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?Gly)。這兩個(gè)氨基酸的改變決定了A2糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，使A2糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性大為降低。此標(biāo)本另外一條等位基因?yàn)镺102等位基因，其與O101等位基因在Exon6第261位胞嘧啶缺失，造成了O基因在261位后發(fā)生閱讀框的移動(dòng)，形成終止密碼子，提前終止了轉(zhuǎn)移酶的翻譯，使其編碼出來的蛋白只有115個(gè)氨基酸，沒有轉(zhuǎn)移酶的催化功能區(qū)。

本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)對(duì)血清學(xué)結(jié)果極像Bx亞型的標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)(血型基因直接測(cè)序和單倍型測(cè)序)，最終定型為Bw03型。提示血清學(xué)亞型的結(jié)果并不可靠。目前已發(fā)現(xiàn)341種ABO等位基因，但是血清學(xué)表型卻沒有這么多，說明一種血清學(xué)表型對(duì)應(yīng)數(shù)種ABO等位基因。鑒于目前我國(guó)對(duì)血清學(xué)亞型報(bào)告較多，且常常缺乏核堿基或氨基酸改變的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議對(duì)血清學(xué)反應(yīng)特殊標(biāo)本例如抗原減弱或正反定型不符的標(biāo)本，不要只根據(jù)血清學(xué)檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)報(bào)告為ABO亞型，應(yīng)采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。目前，核苷酸序列測(cè)定是發(fā)現(xiàn)新等位基因的惟一方法。另外，建議將血清學(xué)反應(yīng)格局特殊的標(biāo)本送能夠進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定的血型參比實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)，避免誤報(bào)。青島市中心血站輸血研究所是我省較早開展ABO亞型基因測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室，具有一定經(jīng)驗(yàn)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)ABO亞型個(gè)體的輸血原則尚缺乏明確的描述，由于A2亞型紅細(xì)胞上A抗原數(shù)量較少，在血型鑒定時(shí)如果將無償獻(xiàn)血者A2亞型誤判為O型輸注給O型受血者，則會(huì)導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)。在37℃有反應(yīng)的抗-A抗體，應(yīng)考慮其是否具有臨床意義，在配血時(shí)應(yīng)加以考慮。但基本遵循同型或相容性輸注原則。對(duì)于本例A205亞型的個(gè)體作為受血者手術(shù)備血，不應(yīng)輸入A型血液制品，此例標(biāo)本血漿中檢出同種抗A1抗體，會(huì)與供者紅細(xì)胞上的A1抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。從現(xiàn)有的血清學(xué)特性和分子機(jī)制來看，應(yīng)輸注O型洗滌紅細(xì)胞，以確保輸血安全。另一方面，由于A2抗原與A1抗原不僅存在量的差異還存在質(zhì)的區(qū)別，使得A2抗原的抗原性較弱。因此臨床醫(yī)生將A2亞型器官捐獻(xiàn)者的心臟、腎臟、肝臟等捐給B型或者O型的器官受體，可使受者器官的生存期明顯延長(zhǎng)［12，13］。

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(收稿日期:2015-03-17)

通信作者:馮智慧

基金項(xiàng)目:青島市市南區(qū)科技發(fā)展資金項(xiàng)目(2013-13-013-YY)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)19-0051-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R457.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.018