丁廣德，姚麗，楊桂梅

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，濟(jì)南250001)

SBR融合蛋白和減毒沙門氏菌免疫對(duì)小鼠涎腺CCL28 mRNA表達(dá)的影響及意義

丁廣德，姚麗，楊桂梅

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，濟(jì)南250001)

目的 探討純化的變形鏈球菌唾液結(jié)合區(qū)段(SBR)頜下腺注射和減毒沙門氏菌(SL)灌胃免疫對(duì)小鼠涎腺黏膜相關(guān)上皮因子CCL28 mRNA表達(dá)的影響。方法 將120只BALB/C小鼠隨機(jī)分為SBR組及SL組各60只。SBR組行SBR融合蛋白頜下腺注射免疫,SL組行SL灌胃免疫。免疫48 h、1周、2周時(shí)采用ELISA法檢測(cè)SBR組唾液中SBR特異性抗體(SBR-IgA)水平； RT-PCR法檢測(cè)兩組頜下腺組織CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量。用另選5例BALB/C正常小鼠作為對(duì)照組。結(jié)果 SBR組免疫48 h及1周、2周時(shí)唾液中SBR-IgA水平均明顯高于對(duì)照組，P均<0.05；SBR組和SL組頜下腺組織CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 SBR融合蛋白經(jīng)頜下腺接種可誘導(dǎo)小鼠明顯的抗體應(yīng)答；經(jīng)頜下腺和經(jīng)胃接種疫苗后涎腺CCL28的表達(dá)明顯增高。

變形鏈球菌；減毒沙門氏菌；齲?。火つは嚓P(guān)上皮趨化因子

唾液中的分泌型IgA(SIgA)在維護(hù)口腔健康、抑制致齲菌斑的形成中有重要作用，被認(rèn)為是抵御齲病病原菌的第一道防線。提高唾液中抗致齲菌變形鏈球菌的特異性抗體水平是防治齲病的有效途徑。黏膜相關(guān)上皮趨化因子CCL28是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CC家族趨化因子，其受體為CCR10和CCR3[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL28 mRNA主要分布于唾液腺、前列腺等組織。有報(bào)道稱人類CCL28可殺死白色鏈球菌、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌、克雷伯肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌[3～5]。涎腺既是黏膜免疫的誘導(dǎo)部位，同時(shí)也是效應(yīng)部位。有研究表明，在涎腺局部行免疫接種，可誘導(dǎo)明顯的以唾液特異IgA升高為特征的黏膜免疫應(yīng)答[6]。2014年1～5月，我們分別觀察了純化的變形鏈球菌唾液結(jié)合區(qū)段(SBR)融合蛋白頜下腺注射及減毒沙門氏菌(SL)灌胃對(duì)小鼠頜下腺內(nèi)CCL28 mRNA和特異性抗體表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為125只SPF級(jí)BALB/C小鼠。取120只隨機(jī)分為SBR和SL組和各60只，兩組均常規(guī)飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，自由進(jìn)食水。SBR組行SBR融合蛋白頜下腺注射免疫：于雙側(cè)頜下腺區(qū)域注射SBR融合蛋白，每只注射40 μg。SL組行SL灌胃免疫：灌胃前4 h撤去飼料和水，灌胃前30 min用5%NaHCO360 μL灌胃中和胃酸；調(diào)SL濃度至1010/mL，取200 μL灌胃。另5只為空白對(duì)照組(對(duì)照組)，自由進(jìn)食水。

1.2 相關(guān)指標(biāo)觀察 免疫48 h及1、2周時(shí)，SL組和SBR組分別處死小鼠20只，取唾液0.2 mL和頜下腺組織0.1 g。頜下腺組織制作標(biāo)本，-70 ℃凍存。

1.2.1 唾液SBR特異性抗體(SBR-IgA)水平 采用ELISA法。取SBR組唾液樣品稀釋5倍后加到酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔中，0.1 mL/孔，將微量酶標(biāo)板用塑料保鮮膜封好，37 ℃孵育2 h；將辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠SBR-IgA稀釋，然后將辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠SBR-IgA(1∶5 000)加到酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中，用塑料保鮮膜封好，37 ℃孵育2 h；于各反應(yīng)孔中加入TMB底物，每孔0.1 mL，用塑料保鮮膜封好，37 ℃蔽光顯色5～30 min，當(dāng)出現(xiàn)明顯的顏色變化時(shí)于酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中加入50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀上測(cè)定各反應(yīng)孔的OD450值，即唾液SBR-IgA水平。

1.2.2 頜下腺組織CCL28 mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法。取兩組凍存的頜下腺組織按每50～100 mg 組織加入1 mL Trizol提取頜下腺組織總RNA；按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取總RNA(約8 μg)，RNase Inhibitor 0.5 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL等，混勻后置于PCR儀中，55 ℃、30min，99 ℃、5 min，5℃、 5min，終止反應(yīng)。取同一個(gè)反應(yīng)體系的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 2.5 μL，β-actin上、下游引物各5 μL，目的基因上、下游引物各5 μL，Taq聚合酶0.25 μL，退火溫度61 ℃、40 min，進(jìn)行PCR反應(yīng)；取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察電泳帶，凝膠成像分析系統(tǒng)掃膠拍照，應(yīng)用軟件測(cè)定電泳條帶的密度值，計(jì)算目的基因片段電泳帶密度與β-actin基因片段電泳帶密度的相對(duì)值，即CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 唾液SBR-IgA水平 SBR組免疫48 h及1、2周時(shí)唾液中SBR IgA水平分別為0.063±0.009、0.053±0.005、0.060±0.017，均高于對(duì)照組的0.036±0.009，P均<0.05。免疫各時(shí)點(diǎn)唾液SBR-IgA比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 頜下腺組織CCL28 mRNA表達(dá) 免疫48 h、1周、2周時(shí)SBR組頜下腺組織CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.245±0.006、0.245±0.009、0.241±0.007； SL組分別為0.255±0.009、0.239±0.006、0.248±0.005，對(duì)照組為0.121±0.008。SBR組和SL組免疫各時(shí)點(diǎn)CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。SBR組及SL組免疫各時(shí)點(diǎn)CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

研究證實(shí)，經(jīng)靶向頜下腺免疫小鼠后，在其頜下腺內(nèi)由效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠影響抗原特異性反應(yīng)，因此檢測(cè)其頜下腺細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子特異性mRNA的表達(dá)非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，SBR頜下腺免疫小鼠頜下腺組織中CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，說(shuō)明SBR免疫可使CCL28mRNA轉(zhuǎn)錄生成增多。鑒于真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄一次只生成一個(gè)mRNA分子)，而且在本研究中除了應(yīng)用SBR蛋白經(jīng)靶向頜下腺免疫動(dòng)物外，未加任何其他因素調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此CCL28 mRNA相對(duì)表達(dá)量可反映SBR蛋白靶向頜下腺免疫CCL28基因的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。

研究表明，通過(guò)某黏膜途經(jīng)接種疫苗產(chǎn)生的特異性IgA不但可遷徙至接種的黏膜組織處，還可歸巢至其他黏膜免疫部位；抗原在腸道被抗原遞呈細(xì)胞捕獲處理后運(yùn)送到PEYRE結(jié)等黏膜相關(guān)淋巴組織，在這里捉捕并處理了抗原的抗原遞呈細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等與抗原特異性Th淋巴細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。其中致敏的部分B細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)型重組后，成為抗原特異性IgA抗體分泌細(xì)胞(IgA+ASC)； IgA+ASC經(jīng)淋巴管進(jìn)入血循環(huán)，遷徙歸巢至機(jī)體的黏膜免疫效應(yīng)部位如涎腺、淚腺等外分泌腺和呼吸道黏膜固有層、腸黏膜固有層等，在這些部位最終分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生并分泌IgA，發(fā)揮效應(yīng)作用[6]。近期研究表明，趨化性細(xì)胞因子CCL28在IgA+ASC經(jīng)血循環(huán)選擇性地在某些黏膜免疫效應(yīng)部位歸巢的過(guò)程中起關(guān)鍵作用；涎腺上皮細(xì)胞表達(dá)分泌至涎腺腺泡間組織中的CCL28可通過(guò)某種機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到局部毛細(xì)血管后靜脈內(nèi)皮細(xì)胞游離面，通過(guò)與IgA+ASC細(xì)胞表面的趨化性細(xì)胞因子受體CCR10特異結(jié)合來(lái)啟動(dòng)IgA+ASC出血管機(jī)制，引導(dǎo)IgA+ASC遷徙歸巢至涎腺[7]。涎腺上皮細(xì)胞表達(dá)的CCL28也可部分地分泌至腺泡腔，隨唾液進(jìn)入口腔[8]?？梢?jiàn)涎腺的雙向分泌特征使得其局部產(chǎn)生的CCL28在口腔防御中發(fā)揮重要作用。

共同黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其作用原理的闡明、新型的黏膜免疫遞送系統(tǒng)和黏膜免疫佐劑的發(fā)現(xiàn)及成功應(yīng)用均為防齲DNA疫苗經(jīng)黏膜免疫接種來(lái)誘導(dǎo)特異的體液和黏膜免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)[9～11]。通過(guò)黏膜途經(jīng)作免疫接種具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可刺激黏膜免疫系統(tǒng)和全身系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，誘導(dǎo)局部產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的免疫記憶[12,13]。唾液腺作為共同黏膜免疫系統(tǒng)的效應(yīng)部位能分泌保護(hù)性抗體IgA，是通過(guò)免疫接種防治齲病及其他感染性口腔疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)黏膜免疫途經(jīng)接種防齲疫苗將有望成為免疫防齲的主要方式。本研究SBR免疫后小鼠頜下腺IgA水平升高，也證明了上述理論。

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2014-11-12)