實時熒光定量PCR技術原理及在食品檢測中的應用*

程海星，郭月英，任霆，張靜，王樂，張利霞，靳燁

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特，010018)

近年來，實時熒光定量PCR技術因其獨特的優(yōu)點，被廣泛的應用于獸醫(yī)、畜牧、動物檢疫、水產養(yǎng)殖等研究領域，成為分子生物學研究中一項重要的技術工具。在食品檢測方面也都有了很大進展，包括致病菌檢測、轉基因食品檢驗、食品摻假檢測等。

1 實時熒光定量PCR技術概述

1.1 實時熒光定量PCR技術基本原理

PCR(polymerase chain reaction)反應技術即為聚合酶鏈式反應，是模擬體內DNA復制的原理在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，實時熒光定量PCR技術(real-time fluorescent quantitative PCR，RTQ-PCR)是在此基礎上發(fā)展起來的實時定量方法，它是1996年由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems)發(fā)明的，Heid等第一個發(fā)展了該方法，使用Taqman探針以FAM和TAMRA分別作為熒光報告染料和淬滅基團［1］。RTQ-PCR技術實現了PCR技術從定性到定量的突破，并且具有很多傳統PCR技術所沒有的優(yōu)點，能夠應用于基因的定量檢測，病原體的檢測，腫瘤基因檢測，基因的表達、突變及多態(tài)性分析等多種科學研究領域［2］。

PCR反應由高溫變性、低溫退火(復性)和適溫延伸等幾步反應組成一個周期循環(huán)，當一個循環(huán)完成，DNA總量增加一倍，若反應重復進行，每次循環(huán)所得的產物都是下一次循環(huán)的模板，從而使模板DNA的拷貝數呈指數(2n)快速增加［3］。RTQ-PCR不僅是對模板DNA進行指數性擴增，而且通過檢測每次循環(huán)PCR產物的總累積量，得到很好的定量結果。RTQ-PCR是在反應體系中加入熒光標記因子，隨著DNA的復制擴增，熒光信號不斷增強，當儀器檢測到熒光信號強度達到設定的熒光閾值時，記錄下此時的循環(huán)數(即CT值)，同時儀器自動繪制出擴增曲線和熔解曲線。利用一系列的數學方法對得到的數據信息進行處理分析，達到實時定量檢測DNA片段的目的［4］。

1.2 實時熒光定量PCR技術分類

根據實時熒光定量PCR所用的熒光模式不同，RTQ-PCR方法分為熒光染料法和熒光探針法2種。

1.2.1 熒光染料法

熒光染料法是在PCR體系中加入熒光染料，熒光染料能非特異性的結合到DNA雙鏈的小溝中，通過熒光信號的積累監(jiān)測反應進行，從而對目的基因進行定量［5］。SYBR Green1是應用最廣泛的一種熒光染料，僅能與DNA雙鏈結合，結合到DNA雙鏈上的SYBR染料能夠發(fā)射熒光信號，而沒有結合的不會發(fā)射，從而保證了熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步［6］。SYBR Green1法因成本低廉，被普遍應用于各種分子生物學實驗研究。此外還有LC Green TM1和Pico Green等新型熒光染料，與SYBR Green1相比，LC Green TM1能夠與dsDNA分子完全結合，高濃度下不會抑制PCR反應，而且其抗水解、抗熱解和抗光解能力均比 SYBR Green1要強［6］。Pico Green比SYBR Green1的靈敏度較高，具有RNA、ssDNA以及其他物質影響小和線性范圍廣等優(yōu)點［7］。熒光染料法的主要優(yōu)勢在于成本低，檢測方法簡單快捷，通用性好，不需要設計探針，能夠高通量的定量PCR檢測。但它不能識別特定的DNA模板，很容易受到引物二聚體和非特異性擴增產物的影響，所以想要得到好的定量結果，對PCR引物的特異性和PCR反應的條件要求較高。

1.2.2 熒光探針法

熒光探針法是利用能與目的DNA片段特異性雜交的探針，對PCR擴增產物進行定量指示，由于其特異性高，主要用于專一序列的DNA檢測。其優(yōu)點是高適應性和可靠性，重復試驗結果高度穩(wěn)定，但當目的基因序列較短時，實驗效果不好［8］。根據熒光基團標記和共振能量轉移的方式，主要分為水解探針和雜交探針，典型的水解探針有 TaqManTM探針和TaqMan MGB探針，雜交探針有雙雜交探針、分子信標和熒光標記引物/探針等［9］。

最常用的水解型探針是TaqManTM探針，它是一種特異性的寡核苷酸探針，兩端分別標記顯色熒光基團和淬滅熒光基團。當探針完整時，顯色熒光基團發(fā)射的熒光被淬滅熒光基團吸收，隨著PCR反應的擴增，Taq酶的5，端外切酶活性把探針降解，使得顯色基團與淬滅基團分離發(fā)出熒光信號。每擴增1條DNA鏈，即可形成1個熒光信號［8］。TaqMan MGB探針是根據TaqMan探針的不足改進起來的，它是將MGB(minor groove binder)分子加在探針的3’端，結合在雙鏈DNA的小溝部分，采用的是非熒光淬滅基團。與TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針更容易配對，分辨率大大提高(可以分辨出一個堿基的差異)［10］，具有熒光本底低、淬滅效果好、標記更靈活、熒光信號信噪比提高等明顯優(yōu)勢。

雙雜交探針是以熒光能量共振轉移(FRET)技術為基礎，所以又稱為FRET探針或Light Cycler探針。它由2條探針組成，一條在5’端標記受體熒光基團，另一條在3’端標記供體熒光基團。在PCR反應過程中，2條探針首尾相連與同一模板鏈的相鄰序列雜交結合，供受體基團產生FRET現象發(fā)出熒光信號。在PCR延伸階段，2條探針在Taq聚合酶作用下分開，熒光消失，所以雙雜交探針法檢測的不是累積信號，而是實時信號［11－12］。分子信標法是利用一種發(fā)卡結構式的單鏈DNA作為探針，在自由狀態(tài)下3’端的熒光報告基團和5’端的淬滅基團相互靠近，熒光被淬滅。在PCR反應過程中，與擴增產物雜交結合的發(fā)卡結構被逐漸拉開，2個末端分離，報告基團發(fā)出熒光［13］。分子信標的特點是能夠循環(huán)使用，敏感度高，可識別出單核苷酸差異的序列，對檢測點突變有很好的效果。

2 實時熒光定量PCR技術應用

到目前為止，通過PCR反應對核酸進行擴增是食品檢測中最常用的方法［14］。實時熒光定量PCR技術以其特有的優(yōu)點，已經廣泛的應用于食品和農畜產品的各個研究領域，包括對mRNA表達分析，食源性致病菌、轉基因食品、菌種分離以及各種食品中動物源性檢測等［12］。

2.1 食源性致病菌檢測

當今食品安全越來越受到人們的關注，這已經成為一個全球性的問題，其中由食品致病菌引發(fā)的一系列食源性疾病是最重要的原因之一。傳統的致病菌檢測方法存在很多弊端已經不能滿足現今的食品安全檢測要求，RTQ-PCR技術的應用為致病菌的快速準確檢測提供了一個很好的技術方法。

沙門氏菌是食品中最重要的食源性致病菌之一，資料顯示，無論是在我國還是在全球范圍內的致病菌食物中毒中沙門氏菌所占比例都非常大，對人和動物產生極大的危害，導致食物中毒、傷害和腸胃炎等多種人類疾?。?5］。杜雄偉［16］等對inva基因設計引物，利用熒光染料法建立了沙門氏菌RTQ-PCR檢測方法，對沙門氏菌的檢測下線到達101CFU/mL，具有很高的靈敏度，能夠快速、準確的檢測肉制品的沙門氏菌，而且操作簡單，耗時短。Rodriguez［17］等利用實時熒光定量PCR法來比較檢測生豬肉和禽肉、生菜沙拉以及綿羊奶制品中的沙門氏菌，結果表明該方法快捷高效，檢出范圍廣，符合ISO標準，實用性很強。

金黃色葡萄球菌是引發(fā)食物中毒的另一種常見致病菌，存在于乳、肉、蔬菜等食物中，能夠產生腸毒素等多種毒素，引起人體產生嚴重感染［18］。Pilla［19］等人建立的雙向實時定量PCR方法來鑒定金黃色葡萄球菌，通過對從90頭乳房炎奶牛中分離的140株菌進行測試，以nuc和Sa442基因為目的基因，結合形態(tài)學和生物化學特征，最后通過基因測序比對，結果顯示該方法敏感性和特異性達到了100%，而且可用于高通量鑒定。又通過對40個牛奶樣品的檢測，表明此方法能直接對牛奶樣品進行乳房炎乳的鑒定。此外，實時熒光定量PCR技術還用于副溶血性弧菌、志賀氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌等致病菌的檢測，并得到了很好的應用［20－21］。

2.2 轉基因食品檢測

隨著大量的轉基因食品進入市場，對轉基因食品的標識、安全性等問題越來越受到關注，傳統的檢測方法中存在敏感性差、操作繁瑣、假陽性等很多缺點，建立準確、快速、靈敏的鑒定方法已經成為當今研究的熱門課題。實時熒光定量PCR技術作為一種新興技術在分子水平上檢測轉基因成分準確性更高，被廣泛應用于轉基因成分的定性、品系鑒定和含量檢測［22］。曹際娟［23］等利用轉基因小麥外源片段與染色體重組的邊界序列設計引物，建立實時熒光PCR反應體系來檢測轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系，并用轉基因玉米、大豆、稻米和非轉基因小麥作對照。這種方法的品系鑒定特異性很好，靈敏度可達到0.01%(m/m)，為檢測含有相同外源基因的不同轉基因小麥品系提供了更為有效的方法，具有較大的應用價值。

2.3 食品中動植物源性檢測

近年來市場上出現了大量食品摻假、摻雜的違法現象，由于受到價格、加工原料、成本等諸多因素的影響，一些不法生產商使用成本較低的材料來冒充生產食品，以此獲取高額利潤。實時熒光定量PCR法在檢測食品中的摻雜成分方面被國內外研究者廣泛應用于實踐生產和實驗研究中，建立了食品中動植物源性多成分的實時熒光定量PCR檢測法［24－26］。傳統的檢測方法多建立在對物種蛋白質的分析上，通過免疫學技術確定某種源性成分［27］。而鑒定DNA分子除了具有種內保守性高、種間特異性強的特點外還有穩(wěn)定性較高的優(yōu)點，可單獨作為物種判別依據［28］。

史艷宇［29］等利用鴨線粒體基因全序列作為靶位點設計探針和引物，以牛肉、羊肉、雞肉、豬肉等畜禽肉制品作為參考物種做特異性檢測，用羊肉DNA(50 mg/kg)溶液對鴨肉DNA稀釋進行靈敏度實驗，成功建立檢測鴨源性成分實時熒光定量PCR方法。結果顯示，該方法設計的引物和探針特異性強，能快速有效檢測鴨源性成分，且羊肉成分存在對鴨肉的靈敏度無影響，靈敏度達到0.1 μg/kg的較高水平。通過對市售加工肉制品中的鴨源性成分檢測，結果檢測出加工肉制品中的鴨源性成分，這種方法應用范圍廣，為食品的摻假制假檢測提供了良好的技術支持。實時熒光定量PCR技術也應用于食品中香蕉成分的檢測，李富威［30］等根據香蕉葉綠體rbcL基因序列的高度保守區(qū)域設計引物和探針對香蕉和55種對照樣品進行特異性檢驗，靈敏度為香蕉DNA 0.000 1 ng/μL，香蕉粉0.001%(m/m)。此外，李楠［31］等人和范麗麗［32］等人還分別實現了肉制品中馬源性成分和豬源性成分檢測的實時熒光定量PCR檢測方法。

2.4 mRNA表達量的研究應用

研究mRNA的表達是實時熒光定量PCR技術一項非常重要的應用［33］。大部分組織細胞都是先將細胞核內的DNA轉錄成mRNA，然后通過核糖體指導合成相應的蛋白質，觀察組織細胞中相應mRNA的表達量是研究組織蛋白的關鍵，實時熒光定量PCR具有準確、快速、靈敏等優(yōu)點，能夠在研究中準確分析基因mRNA的表達水平。

國內外關于利用熒光定量PCR技術研究mRNA表達的報道有很多，其主要實驗步驟為:先提取樣品中的總RNA并反轉錄成cDNA，然后用設計好的引物對cDNA進行熒光定量PCR擴增，并對總RNA和PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，接著將擴增產物純化回收后克隆測序比對，并以倍數梯度稀釋cDNA制作擴增效率曲線，最后分析數據和討論實驗結果。黃雅娟［34］等在文章中詳細說明了建立綿羊嫩度相關基因mRNA表達量的熒光定量PCR的檢測方法。Fan［35］等研究了MYF-6基因在杜洛克豬和皮特蘭豬出生后骨骼肌中的表達規(guī)律，使用SYBR熒光染料進行相對表達量分析，發(fā)現在腰眼肌中皮特蘭豬MYF-6基因的表達量高于杜洛克豬，具有重要的意義。李劍虹［36］等使用熒光定量PCR方法研究了AA雞肉PCK1基因的表達量與冷刺激時間的關系，選用相對定量法處理數據，詳細探討了隨著冷刺激處理時間的不同，PCK1基因在AA肉雞肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和胸腺等不同組織部位的表達變化及原因。

3 實時熒光定量PCR技術展望

雖然實時熒光定量PCR技術有許多優(yōu)點，但也存在不足之處，如實驗設備要求高，試劑材料價格昂貴，不能實時檢驗出PCR產物的大小，實驗數據處理方法繁瑣等。隨著技術的發(fā)展，RTQ-PCR技術也會不斷得到改進和完善，尤其是與基因芯片、高通量測序等其他生物技術相結合，其諸多優(yōu)點會顯示出更強大的優(yōu)勢，被越來越多的科學研究者接受。在未來的發(fā)展趨勢中，實時熒光定量PCR技術在食品質量控制領域會是一種非常好的工具，在食品安全檢測的很多方面也會成為一種新的檢測標準。

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