王書(shū)珍等

摘要：利用FIASCO方法（Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats）構(gòu)建杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的（AG）n微衛(wèi)星富集文庫(kù)。通過(guò)菌液PCR檢測(cè)，從（AG）n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的356個(gè)陽(yáng)性菌落中篩選了233個(gè)進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，202個(gè)序列富含SSR位點(diǎn)，陽(yáng)性比率達(dá)86.7%。去除雜峰、疊峰、信號(hào)弱的序列，最終篩選39個(gè)供后續(xù)引物開(kāi)發(fā)使用，其中完美型SSR有22個(gè)，不完美型5個(gè)，混合型12個(gè)。磁珠富集法構(gòu)建杜鵑基因組微衛(wèi)星文庫(kù)是一條高效可行的途徑，為微衛(wèi)星位點(diǎn)的分離、杜鵑種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）；微衛(wèi)星；探針；富集文庫(kù)

中圖分類號(hào)：S685.21；Q343.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0627-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.030

Constructing Microsatellite-enriched Library of Rhododendron simsii Planch.

WANG Shu-zhen，JIN Wei-bin，XIANG Jun，ZHENG Yong-liang，F(xiàn)ANG Yuan-ping，

GAN Jian-ping，CHENG Hua，DU Hang

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： （AG）n microsatellite-enriched library of Rhododendron simsii Planch. was constructed by FIASCO（Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats） method. Among 356 positive colonies verified by colony PCR of （AG）n microsatellite-enriched library， 233 colonies were chosen for further sequencing. Results showed that 202 colonies contained microsatellites， accounting for 86.7%. Discarding sequences with miscellaneous peak， overlapping peaks and weak signal， 39 sequences were selected for primer exploitation. The perfect， imperfect and compound microsatellite repeat types were 22， 5 and 12， respectively. The FIASCO method was efficient for constructing the enrichment library of R. simsii Planch. microsatellite. It will lay foundation for developing microsatellite markers and studying genetic diversity and genetic structure of Rhododendron species.

Key words： azalea（Rhododendron simsii Planch.）； microsatellite； probe； enriched library

杜鵑花（Rhododendron spp.）泛指杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）植物，具有極高的觀賞價(jià)值，并被譽(yù)為“花中西施”和“木本花卉之王”[1，2]。杜鵑花在亞洲、歐洲、北美洲等地廣泛分布，并且因氣候條件不同而垂直分布明顯，從而形成了常綠大喬木、常綠小喬木、常綠灌木、落葉灌木等不同形態(tài)特征的地理居群[3]。杜鵑花兼有美學(xué)觀賞、生態(tài)保護(hù)、藥用治療、科學(xué)研究等價(jià)值[1]。杜鵑花屬近1 000種，中國(guó)有571種，其中特有種多達(dá)400多個(gè)[4]。在中國(guó)，云南、西藏、四川三省（自治區(qū)）交匯處的橫斷山脈是世界杜鵑花的發(fā)源地和分布中心[5]。近幾年來(lái)，在氣候變化與人類活動(dòng)日漸加劇的大背景下，杜鵑花的種質(zhì)資源也受到不同程度的影響，甚至出現(xiàn)退化現(xiàn)象。因此，亟須對(duì)現(xiàn)有的杜鵑花資源進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)，并制定切實(shí)可行的遺傳保護(hù)策略。

微衛(wèi)星（Microsatellite），又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是以1～6 bp核苷酸為重復(fù)單位且均勻分布于生物基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星標(biāo)記因其分布廣泛、多態(tài)性強(qiáng)、信息含量豐富、遺傳穩(wěn)定性好、共顯性遺傳等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于作物的遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳育種、圖譜構(gòu)建、基因定位、親緣關(guān)系分析及種質(zhì)資源鑒定等研究中[6-9]。Naito等[10]率先從R. metternichii基因組內(nèi)開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記。Tan等[11]從 R. simsii 基因組內(nèi)開(kāi)發(fā)了8個(gè)SSR標(biāo)記。Wang等[12]從R. decorum基因組內(nèi)開(kāi)發(fā)了24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。Wang 等[13]從 R. delavayi 和 R. decorum基因組內(nèi)開(kāi)發(fā)了38對(duì)SSR引物，其中9對(duì)可以跨物種擴(kuò)增。Delmas等[14]Charrier等[15]用454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)從R. ferrugineum基因組內(nèi)開(kāi)發(fā)了18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。

現(xiàn)有的SSR標(biāo)記難以滿足對(duì)杜鵑花種群的遺傳變異特征、基因流、種群進(jìn)化歷史、遺傳圖譜構(gòu)建等研究中對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量的需求。因此，本研究以（AG）n為探針構(gòu)建杜鵑花特有種杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)，旨在為杜鵑花群體遺傳學(xué)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、花期性狀基因的關(guān)聯(lián)分析、QTL定位等研究提供高效的SSR標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源 杜鵑樣品取自湖北省麻城市龜峰山山頂“杜鵑花王”的幼嫩葉片。樣品采集后置于自封袋內(nèi)，并放入冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室置-80 °C冰箱備用。

1.1.2 試劑 DNA限制性內(nèi)切酶MseI、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB（NewEngland Biolabs）。Taq DNA 聚合酶、dNTPs均購(gòu)天根生物公司。鏈霉親和素磁珠M-280試劑盒（Dynalbeads M-280 Streptavidin，112-05D）、磁珠收集器（Dynal MPC，123-20D）購(gòu)于Invitrogen。克隆載體pMD18-T購(gòu)于TaKaRa，轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞由經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。AFLP接頭序列Oligo-MseI-A（5′-TACTCAGGACTCAT-3′）和Oligo-MseI-B（5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。生物素標(biāo)記的（AG）n探針由Invitrogen生物公司合成： 5′-Biotin-（AG）13。MseI-N混合組由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′，N=A， T， G， C。M13通用引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 DNA提取方法參照改良的CTAB提取法[16]，并略作修改。提取的“杜鵑花王”基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后，記錄原始結(jié)果，并將基因組DNA稀釋至終濃度為100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建 參照FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats）方法構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)[17]。利用MseI 限制性內(nèi)切酶對(duì)1 μg的基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切成功的標(biāo)準(zhǔn)是出現(xiàn)100～1 000 bp的彌散帶譜；將酶切后的基因組 DNA 片段回收并加 Mse I接頭（Oligo-MseI A 和Oligo-MseI B）；利用Mse I-N引物對(duì)連接片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增（12/14/16/18/20個(gè)循環(huán)），篩選擴(kuò)增產(chǎn)物剛剛能在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物（100～1 000 bp）；將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物先后與Biotin-（AG）13 探針和鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行雜交，經(jīng)過(guò)系列非嚴(yán)格洗脫和嚴(yán)格洗脫后回收目的DNA片段；對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，回收200～800 bp的片段，與pMD18-T載體進(jìn)行TA克隆并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布在含有氨芐霉素的培養(yǎng)基上。

1.2.3 陽(yáng)性克隆的測(cè)序及分析 經(jīng)氨芐抗性篩選和IPTG誘導(dǎo)后，挑取白色克隆。以M13通用引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分析，挑取擴(kuò)增片段大于500 bp的克隆交由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。以M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序，序列比對(duì)拼接后用在線軟件VecScreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/）去除載體序列和MseI接頭序列。利用軟件TRF（Tandem repeat finder，version 3.2.1）[17]查找序列的微衛(wèi)星位點(diǎn)。按照Weber[18]的微衛(wèi)星分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)杜鵑花基因組SSR位點(diǎn)進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的杜鵑基因組DNA

提取的“杜鵑花王”基因組DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)比較完整的DNA條帶，條帶大于20 kb，并且無(wú)明顯的DNA降解現(xiàn)象（圖1）。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的“杜鵑花王”基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)改良的CTAB法所提取的杜鵑花基因組DNA濃度和純度均比較好，OD260 nm/OD280 nm=1.746 3，DNA的濃度為3.76 μg/μL。因此，提取的DNA適合后續(xù)杜鵑花微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建。

2.2 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建以及鑒定

對(duì)1 μg“杜鵑花王”基因組DNA的酶切結(jié)果見(jiàn)圖2，與未處理的對(duì)照樣品相比，經(jīng)MseI限制性內(nèi)切酶酶切的DNA呈彌散帶型，并且大小分布在100～1 000 bp之間，符合微衛(wèi)星富集文庫(kù)構(gòu)建的要求。將回收后的酶切片段與MseI接頭相連，并對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)資料，設(shè)置不同的循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，16個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上剛剛能夠呈現(xiàn)，小于14個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物太少而不適合下游的磁珠富集，而多于18個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致下游陽(yáng)性克隆子重復(fù)出現(xiàn)，因此選擇16個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物與Biotin-（AG）13探針進(jìn)行雜交。經(jīng)多次雜片段的洗脫后，采用95 ℃預(yù)熱的TE溶液洗脫與探針雜交的目的片段，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行TA克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)。經(jīng)氨芐抗性篩選和IPTG誘導(dǎo)后，從平板上挑取了356個(gè)克隆子。經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，挑取233個(gè)克隆片段大于500 bp的克隆交由測(cè)序公司測(cè)序（圖3）。

2.3 測(cè)序分析

對(duì)上述測(cè)序的克隆，舍棄雜峰、信號(hào)弱的序列，最終得到（AG）n微衛(wèi)星富集文庫(kù)的202條序列片段，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。在富含微衛(wèi)星位點(diǎn)的202條序列內(nèi)，有26個(gè)序列在微衛(wèi)星位點(diǎn)的下游出現(xiàn)了疊峰；還有31個(gè)序列在微衛(wèi)星位點(diǎn)的上游側(cè)翼序列過(guò)短，不適合后續(xù)的SSR引物設(shè)計(jì)；6個(gè)克隆與其他序列有重復(fù)。因此，最后挑選了139個(gè)序列供后續(xù)研究。

利用在線TRF軟件對(duì)139條微衛(wèi)星序列片段進(jìn)行分析，（AG）n文庫(kù)內(nèi)序列的主要重復(fù)類型為（AG）n、（GA）n、（CT）n、（TC）n，以及由這些微衛(wèi)星重復(fù)單元組成的復(fù)合型微衛(wèi)星。在所檢測(cè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)內(nèi)，重復(fù)次數(shù)最少為8次，最多可達(dá)36次，主要重復(fù)次數(shù)分布在22～31之間。不完美型的微衛(wèi)星位點(diǎn)，重復(fù)序列之間插入的堿基數(shù)為3～7個(gè)，以胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸堿基居多。復(fù)合型微衛(wèi)星內(nèi)既有（TC）n與（TA）n雙堿基重復(fù)的混合類型，也有（GA）n與（AT）n混合的類型，更有Cn和（CT）n類型的重復(fù)組合。

利用Primer Premier 5.0軟件對(duì)重復(fù)次數(shù)大于12的序列進(jìn)行分析，有39個(gè)序列能夠設(shè)計(jì)出得分大于85分的SSR引物，可用于SSR引物開(kāi)發(fā)的序列。這39個(gè)序列內(nèi)部的微衛(wèi)星類型、5′核心序列、3′端側(cè)翼序列如表1所示。依據(jù)Weber[19]提出的標(biāo)準(zhǔn)為序列進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)杜鵑的微衛(wèi)星富集文庫(kù)內(nèi)以完美型微衛(wèi)星類型居多：完美型SSR有22個(gè)，占56.41%；不完美型5個(gè)，占12.82%；混合型SSR有12個(gè)，占30.77%。

3 小結(jié)與討論

在湖北麻城的龜峰山風(fēng)景區(qū)內(nèi)，有著連片面積達(dá)6 000多公頃的杜鵑花灌木叢，建群種主要是杜鵑。該杜鵑群落的平均樹(shù)齡在100～300年之間，而被譽(yù)為“杜鵑花王”的樹(shù)齡大于500年，是世界上迄今為止發(fā)現(xiàn)的面積最大、品種最純、分布最集中的野生古杜鵑群落。龜峰山風(fēng)景區(qū)的杜鵑特有種和變種不僅為湖北省生態(tài)旅游業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，也為杜鵑的遺傳育種提供了優(yōu)良的材料[6]。因此，亟須對(duì)麻城杜鵑種質(zhì)資源進(jìn)行研究，而SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是首要任務(wù)，微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建則是從基因組信息未知的物種內(nèi)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的前提。

微衛(wèi)星標(biāo)記可以通過(guò)基因組分離、數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘、近緣物種轉(zhuǎn)移等途徑獲得。微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是一件繁瑣且耗時(shí)的工作，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分離方法效率低且耗時(shí)，陽(yáng)性率多為0.04%～12%[20]。本研究通過(guò)對(duì)基因組DNA的MseI酶切、特定接頭的連接、MseI-N簡(jiǎn)并引物的PCR預(yù)擴(kuò)增、生物素探針雜交、磁珠富集、多次洗脫、回收目的片段等途徑構(gòu)建了杜鵑花（AG）n微衛(wèi)星富集文庫(kù)，陽(yáng)性克隆比率高達(dá)86.7%。

在構(gòu)建（AG）n文庫(kù)的同時(shí)，也同時(shí)利用生物素標(biāo)記的（AT）13、（GCC）9、（CTAT）6探針構(gòu)建富集文庫(kù)，但最終只從篩選平板上各挑取了15、9、7個(gè)克隆，測(cè)序分析均為陰性，可能的原因是杜鵑花基因組內(nèi)（AT）n、（GCC）n、（CTAT）n類型的微衛(wèi)星位點(diǎn)比較少見(jiàn)。在（AG）n文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，選擇的是（AG）13探針，主要是因?yàn)樘结樦袎A基的增加會(huì)直接影響雜交退火溫度和雜交的效率，而堿基過(guò)少則影響陽(yáng)性克隆率。

采用菌液PCR技術(shù)對(duì)克隆子進(jìn)一步篩選，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大于500 bp的克隆才會(huì)進(jìn)行下一步的測(cè)序分析。M13通用引物所擴(kuò)增的片段包括載體序列和外源插入序列，因此如果片段過(guò)短，即便是含有微衛(wèi)星位點(diǎn)，其兩側(cè)也沒(méi)有足夠的側(cè)翼序列供SSR引物的開(kāi)發(fā)，因此選擇片段長(zhǎng)度大于500 bp的克隆。據(jù)以往在蓮、苦瓜、慈姑等物種內(nèi)的研究經(jīng)驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)大于12的二堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體內(nèi)的多態(tài)性比較豐富[17]。因此，結(jié)合Primer Premier 5.0軟件的分析結(jié)果，最終篩選39個(gè)序列以供后期杜鵑花基因組SSR引物的設(shè)計(jì)。

綜上所述，F(xiàn)IASCO富集法能夠有效地從杜鵑基因組DNA內(nèi)分離到微衛(wèi)星座位，在所測(cè)序的233個(gè)克隆內(nèi)，202個(gè)序列富含SSR位點(diǎn)，陽(yáng)性比率高達(dá)86.7%，便于后續(xù)的引物設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，同時(shí)為麻城龜峰山杜鵑種質(zhì)資源現(xiàn)狀的遺傳評(píng)估、遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)分析、QTL定位、種群進(jìn)化潛力和進(jìn)化路線的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 康用權(quán)，彭春良，廖菊陽(yáng)，等.湖南杜鵑花資源及其開(kāi)發(fā)利用[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（8）：57-63.

[2] 鮮小林，陳 睿，秦 帆，等.四川杜鵑花資源調(diào)查及其育種意義研究[J].北方園藝，2012（2）：92-96.

[3] 馮國(guó)楣.花中西施杜鵑花[J].園林，2008（12）：124-125.

[4] 趙喜華，張樂(lè)華，王曼瑩.11種杜鵑花RAPD分類學(xué)初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（4）：544-547.

[5] WANG X Q， HUANG Y A， LONG C L. Cross-amplification and characterization of microsatellite loci for the genus Rhododendron[J]. Hortscience， 2010， 45（9）： 1394-1397.

[6] 彭 嬋，張新葉，楊彥伶，等.湖北麻城杜鵑古群落遺傳多樣性研究[J].湖北林業(yè)科技，2010（4）：26-30.

[7] GAO G Q， HE G H， LI Y R. Microsatellite enrichment from AFLP fragments by magnetic beads[J]. Acta Botanica Sinica， 2003， 45（11）： 1266-1269.

[8] ZHAO D， YANG J， YANG S， et al. Genetic diversity and domestication origin of tea plant Camellia taliensis （Theaceae） as revealed by microsatellite markers[J]. BMC Plant Biology， 2014， 14（1）： 14.

[9] RAGHAMI M， L PEZ-SES A I， HASANDOKHT M R， et al. Genetic diversity among melon accessions from Iran and their relationships with melon germplasm of diverse origins using microsatellite markers[J]. Plant Systematics and Evolution， 2014， 300（1）： 139-151.

[10] NAITO K， ISAGI Y， NAKAGOSHI N. Isolation and characterization of microsatellites of Rhododendron metternichii Sieb. et Zucc. var. hondoense Nakai[J]. Molecular Ecology， 1998， 7： 927-928.

[11] TAN X X， LI Y， GE X J. Development and characterization of eight polymorphic microsatellites for Rhododendron simsii Planch.（Ericaceae）[J]. Conservation Genetics， 2009， 9（1）： 326-329.

[12] WANG X， HUANG Y， LONG C. Isolation and characterization of twenty-four microsatellite loci for Rhododendron decorum Franch.（Ericaceae）[J]. HortScience， 2009， 44（7）： 2028-2030.

[13] WANG X Q， HUANG Y A， LONG C L. Cross-amplification and characterization of microsatellite loci for the genus Rhododendron[J]. Hortscience， 2010， 45（9）： 1394-1397.

[14] DELMAS C E L， LHUILLIER E， PORNON A， et al. Isolation and characterization of microsatellite loci in Rhododendron ferrugineum（Ericaceae） using pyrosequencing technology[J]. American Journal of Botany，2011，98（5）： e120-e122.

[15] CHARRIER O， DELMAS C E L， PORNON A， et al. Development of 18 microsatellite markers in Rhododendron ferrugineum（Ericaceae） for investigating genetic structure at margins[J]. Conservation Genetics Resources， 2013， 5（2）： 473-477.

[16] 張艷紅，沈向群，劉旭穎，等.北方露地杜鵑DNA的提取[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：31-32.

[17] WANG S Z， PAN L， HU K， et al. Development and characterization of polymorphic microsatellite markers in Momordica charantia（Cucurbitaceae）[J]. American Journal of Botany， 2010， 97（8）： e75-e78.

[18] WEBER J L， MAY P E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction[J]. American Journal of Human Genetics， 1989， 44： 388-396.

[19] WEBER J L. Informativeness of human （dC-dA）-（dG-dT）n polymorphisms[J]. Genomics， 1990， 7（4）：524-530.

[20] ZANE L， BARGELLONI L， PATARNELLO T. Strategies for microsatellite isolation：A review[J]. Molecular Ecology， 2002， 11（1）： 1-16.